SARS病毒E蛋白基因与EGFP基因在BHK-21细胞中的融合表达

目的:构建SARS病毒E蛋白基因的真核表达载体,观察E蛋白基因在BHK鄄21细胞中的正常表达及定位。方法:用PCR方法扩增E蛋白基因,上、下游引物两端分别设计EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点,产物双酶切后定向克隆于pEGFP鄄N1载体,构建真核表达载体pEGFP鄄E,脂质体法转染BHK鄄21细胞,荧光显微镜观察E蛋白基因的表达。结果:经酶切和DNA序列测定鉴定,E蛋白基因正确插入到增强绿荧光蛋白EGFP基因上游,荧光显微镜显示E蛋白表达于细胞浆内,包膜上也有分布。结论:在BHK鄄21细胞中成功表达了SARSCovE鄄EGFP融合蛋白,蛋白定位于细胞浆内。

酵母表达的风疹病毒E1在ELISA检测中应用

目的将毕赤酵母表达系统中表达的E1糖蛋白作为包被抗原,建立一种优于病毒作为包被抗原的风疹病毒(rubellavirus,RV)抗体ELISA检测方法。方法将重组包膜糖蛋白(E1)抗原和风疹病毒分别作为包被抗原,用间接ELISA法检测90份临床血清标本,同时用晶美(JINGMEI)进口分装试剂盒和德国RECI公司试剂盒进行检测;将RECI试剂盒作为金标准,计算另外三者检测结果的特异性、灵敏性和符合率;比较他们之间的差异有无统计学意义,特别是重组抗原与病毒抗原作为包被抗原检出RV抗体阳性率的差异有无统计学意义。结果重组蛋白重复性实验结果经统计学处理,P>0·05,差异无统计学意义;RECI试剂盒与重组抗原、病毒抗原的检测结果差异有统计学意义(P<0·05);重组抗原与病毒抗原的检测结果差异有统计学意义(P<0·05),作为包被抗原,重组抗原优于病毒抗原。结论用毕赤酵母表达的RVE1重组蛋白作为包被抗原进行ELISA检测优于病毒作为包被抗原,具有广阔的应用前景。

肾综合征出血热病毒基因型和流行特点分析

目的 探讨山东省汉坦病毒 (HV)主要流行株的基因型和流行特点。方法 采集山东地区有代表性的鼠肺标本 ,应用逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)扩增技术及核苷酸序列测定方法对免疫荧光抗原阳性的标本进行HVG2基因扩增并测序 ,与原有山东毒株一起进行同源性分析、系统发生树分析。结果 山东省新分离 18株HV均为汉城 (SEO)型 ,与以往山东SEO型HV有较高同源性 ,在 95 . 7%以上 ,属于同一亚型。山东省汉滩 (HTN)型HV同源性较低 ,在 77. 9%以上 ,属于不同亚型。结论 山东省HV是以SEO型为主的SEO和HTN混合型疫区。SEO型基因变异率低 ,有较高的稳定性。而HTN型HV变异率高 ,稳定性差。

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白基因表达载体的构建及表达

目的构建汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白G1、G2的真核表达载体并将其在Vero E6细胞中进行表达,观察细胞融合现象。方法采用PCR和基因克隆技术,将GM04-38株G1、G2基因分别克隆到表达载体pCAGGS/MCS,酶切和测序鉴定正确后,将表达载体pCAGGS-G1、pCAGGS-G2共转染Vero E6细胞,酸性MEM处理后观察细胞融合现象的产生,并以间接免疫荧光试验(IFA)观察糖蛋白的表达情况。结果显示在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白G1、G2,IFA显示荧光信号分布在细胞浆中。二者的共表达可产生良好的生物学活性,在偏酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合,而转染pCAGGS-NP的细胞没有融合现象发生。共表达也未出现明显的促进效应。结论成功构建了糖蛋白G1、G2的表达载体,并在Vero E6细胞中呈有效表达,二者的共表达可在偏酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合。

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白M的基因克隆与序列分析

目的:建立汉坦病毒(HV)包膜糖蛋白M的克隆载体;研究M基因的变异情况,并对其序列进行系统发生树分析。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增GM04-38M片段的基因,产物纯化后克隆于PMD-18T载体,经氨苄青霉素筛选,酶切鉴定,并进行序列测定,应用DNASTAR软件将它与世界范围内分离的病毒株同一基因序列分析比较。结果:筛选出含有HVM蛋白基因的克隆。GM04-38株M片段的全基因序列共3651个核苷酸,4种核苷酸的比例分别为:A30.46%,T30.13%,G20.84%,C18.57%。序列同源分析表明,GM04-38株与Z37株核苷酸同源性最高(97.3%),属于SEO型HV。与其他SEO各株的差别均小于18.0%;绘出了核苷酸系统发生树。结论:成功地建立汉坦病毒M蛋白基因克隆载体;中国不同地区汉坦病毒流行株基因序列存在明显差异。这为研究HV遗传与变异以及制备有效的亚单位疫苗奠定了基础。

菏泽市定陶区一起水痘聚集性疫情的流行病学调查报告

菏泽市定陶区某小学2022年6月3—8日发生一起水痘聚集性疫情,疾控中心对流行情况进行流行病学调查和消毒处置。本次疫情总病例数为14例,罹患率为3.56%,男女性别比为1.33∶1,全部病例均发生在一年级2班,2例病例明确有1次免疫接种史,其余12例接种史不详,通过停课、居家隔离、环境消毒和应急接种等措施,疫情得到有效控制。水痘传染性较强,尽早发现、隔离、治疗、环境消毒和接种水痘疫苗是防止疫情扩散的重要举措。乡镇卫生院及学校教师要提高对疫情的敏感性,积极开展卫生健康教育,做好水痘疫苗知识的宣传普及工作,提高适龄儿童两剂次水痘疫苗接种率,以降低水痘发病率,控制水痘暴发。

山东省11株人星状病毒的全基因组序列特征分析

目的了解山东省人星状病毒(HAstV)的全基因组特征。方法收集山东省2020—2022年急性弛缓性麻痹病例监测系统的粪便标本,采用实时荧光定量PCR检测HAstV核酸,针对阳性标本应用下一代测序技术对HAstV的全基因组序列进行测定和分析,进行型别鉴定,使用BioEdit和Mega软件进行同源性比较和系统发生学分析。结果共检测了667份标本,14份为HAstV核酸阳性(2.1%),其中HAstV-1基因型6份,MLB1基因型6份,MLB2基因型1份,VA2基因型1份。共有11份标本获得了全基因组序列。其中,6株HAstV-1型本地序列之间的核苷酸相似性为98.2%~99.9%,与其他地区HAstV-1的全基因组序列的核苷酸相似性为87.6%~98.6%;4株MLB1型本地序列之间的核苷酸相似性为99.1%~99.9%,与其他地区的MLB1型全基因组序列相似性为92.2%~99.4%;1株VA2型本地序列与其他VA2型全基因组序列相似性为96.0%~96.3%。基于ORF2编码区的系统发生学结果显示,HAstV-1型本地序列与日本株具有较为密切的亲缘关系,且与基于ORF1a、ORF1b序列的系统发生树拓扑结构不一致。结论共获得11株HAstV的全基因组序列,并发现了VA2型序列。

2020-2022年济南市污水中札如病毒的型别构成及其分子特征

札如病毒(Sapovirus, SaV)具有高度的遗传多样,是引起散发或暴发病毒性胃肠炎的重要病原体之一。为了解中国东部地区人类SaV的流行情况及其基因型多样性,本研究于2020年1月至2022年12月,在山东省济南市采集并处理了36份污水样本,实时荧光定量RT-PCR检测显示33份(91.67%)污水样本为阳性;使用巢式RT-PCR对部分VP1序列进行扩增,电泳显示16份样本为阳性(44.4%);对扩增产物分别进行下一代测序(Next generation sequencing, NGS)和分析,共鉴定出7种SaV基因型,属于GI、GII和GV三个基因群,包括5种主要基因型(GI.1、GI.2、GI.6、GII.1和GV.1)和2种不常见的基因型(GII.3和GII.5);研究期间内,优势基因型在2021年4月前后由GI.2型转换为GI.1型。基于部分VP1序列的系统发生学分析显示本地序列和外来序列在某些分支中聚集,具有密切的亲缘关系。本研究丰富了新冠疫情以来三年内札如病毒的分子流行病学特征,证明了基于NGS的环境污水监测可以增加人们对SaV流行状况的认识,对深入研究我国SaV的分布及流行具有重大意义。

1例接种新型冠状病毒灭活疫苗偶合两种病原体感染调查

目的调查某中年女性发生肝脓肿、肺炎支原体感染与注射新型冠状病毒灭活疫苗的关系。方法县乡两级专业人员于2021年6月25日—7月10日开展个案调查,提取受种方、疫苗生产企业和接种方相关资料。市级预防接种异常反应调查诊断专家组于2021年8月2日对该疑似预防接种异常反应(adverse events following immunization,AEFI)病例开展调查诊断,并做出诊断意见。结果该病例于2021年5月6日9:40接种新型冠状病毒灭活疫苗,留观30min内无异常。于2021年5月14日—6月19日以“发热”为主诉,先后在三家医院住院治疗,住院期间行肝脏穿刺液培养诊断为肺炎克雷白杆菌阳性,血生化检验结果显示肺炎支原体抗体-免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)阳性,多次检测新型冠状病毒核酸结果均阴性。出院诊断主要为肝脓肿、双侧肺炎、感染性发热。疫苗质量合格,预防接种过程符合操作规程。市级调查诊断结论为偶合症。结论该病例接种新型冠状病毒灭活疫苗与肺炎支原体、肺炎克雷白杆菌感染的发生无因果关系,诊断为接种疫苗的偶合感染。

2015-2021年山东省菏泽市水痘流行病学特征分析

目的分析2015-2021年山东省菏泽市水痘流行病学特征,为水痘的预防控制提供科学数据。方法通过中国疾病预防控制信息系统收集2015-2021年山东省菏泽市水痘发病情况,分析其时间、地区、人群分布特征。结果2015-2021年山东省菏泽市共报告水痘发病7264例,各年度发病率分别为9.29/10万、9.95/10万、11.36/10万、16.46/10万、19.79/10万、9.31/10万、7.17/10万,年均报告发病率为11.93/10万。除2018年和2019年以外,各年度的发病高峰均出现在4-7月和10月-次年1月。发病数较多的人群依次为学生3063例(42.17%)、散居儿童1873例(25.78%)、幼托儿童1124例(15.47%)。发病数较多的年龄依次为5~9岁2596例(35.74%)、0~4岁1804例(24.83%)、10~14岁1135例(15.63%)。结论2015-2019年山东省菏泽市水痘报告发病率呈逐年上升趋势,2020-2021年发病率有所下降,儿童为发病高危人群。

基于下一代测序技术分析临沂市污水中肠道病毒的遗传多样性

本研究通过环境污水监测和下一代测序(Next generation sequencing,NGS)技术来了解临沂市肠道病毒(Enterovirus,EV)的型别分布和遗传特征,为肠道病毒病的防控提供科学依据。我们从2019年1月至2021年12月,在山东省临沂市兰山区污水处理厂按月采集污水标本,使用阴离子膜吸附洗脱法对标本进行浓缩,接种RD、HEp-2、L20B细胞进行EV分离和型别鉴定;同时,提取污水浓缩液核酸,进行VP1部分编码区的RT-PCR扩增和扩增产物的NGS,分析不同EV型别的读序构成,并使用Mega 11.0和BioEdit 7.0进行序列分析。3年中共采集污水样本34份,其中从23份中分离到EV 257株,鉴定为8个型别;28份污水浓缩液核酸的RT-PCR反应呈阳性,通过NGS共检出29个EV型别,分别属于EV-A(8)、EV-B(15)、EV-C(6)。其中柯萨奇病毒B3型(Coxsackievirus B3,CVB3)、埃可病毒11型、CVA16型为读序数最多的3种血清型,分别占总读序数的24.5%、23.1%和8.2%,同时还检出肠道病毒A76型、A89型、A90型等3种新型EV,以及EV-A71、CVA4、CVA6、CVA10、CVA24等传统病毒分离方法难以从污水中检测到的型别。系统发生学分析显示国内的新型病毒与国外分离株的亲缘关系较远。由此我们得出结论,基于NGS技术的环境污水监测是探索EV区域性流行的敏感且有效的手段。临沂环境污水中存在多种肠道病毒的共循环,具有高度的遗传多样性。

山东省2021年蚊虫中Kadipiro病毒的全基因组序列特征

对2021年采集自山东省微山县蚊虫中的Kadipiro病毒(Kadipiro virus,KDV)进行分离鉴定和全基因组序列特征分析。将蚊虫标本研磨处理后接种细胞进行病毒分离,应用下一代测序技术对病毒分离物的全基因组序列进行测定,使用BioEdit 7.0.5.3软件进行相似性比较,使用Mega 11.0软件进行系统发生分析。成功分离到4株KDV,分别命名为SD21264、SD21397、SD21398和SD21399,均分离自三带喙库蚊。该4株KDV均能引起C6/36细胞产生明显的细胞病变,表现为细胞圆缩、间隙变大,但不能引起BHK21细胞病变。核苷酸相似性分析显示山东株中除了第7节段和第11节段之外,其他各节段互相之间的一致性大多>98.0%;与GenBank已有的4个KDV基因组序列相比,本研究分离株与我国2013年分离株(QTM27331)和2016年分离株(SDKL1625)的核苷酸一致性较高,其中片段1、3、6、9的一致性>98.0%;而与印尼株JKT-7075和丹麦株21164-6/M.dau/DK/2015的一致性较低,大多数片段在80%~90%之间。系统进化分析显示本研究分离株大部分节段与我国2016年分离株(SDKL1625)的进化关系最近,但7、11等部分节段有基因重排发生的证据。本研究结果丰富了Kadipiro病毒的全基因组信息。应加强对该病毒的监测,探索其与人类发热或脑炎等疾病的关联。

二代测序技术分析2018年济南市污水中的人星状病毒基因特征

人星状病毒(Human astrovirus,HAstV)是引起急性胃肠炎的主要致病病毒之一,为了解HAstV的型别分布和遗传变异特征,本研究于2018年在济南市按月采集12份生活污水样本,浓缩处理后提取RNA,进行HAstV部分ORF2编码区的PCR扩增,阳性产物进行下一代测序(Next generation sequencing, NGS)分析,探索HAstV各型别的动态变化和系统发生学特征。结果显示所有污水中均检出HAstV核酸,NGS分析显示所测读长分属于HAstV-1至HAstV-6共6个型别,其中HAstV-1型占比最大(27.4%),但不同月份的优势型别有所差别。系统发生学分析显示HAstV-1、HAstV-2、HAstV-5型山东株序列属于多个遗传分支,提示这些型别有多个传播链在当地循环。本研究描述了2018年济南市本地流行的人星状病毒基因型分布和序列特征,研究结果证明基于扩增子NGS的环境监测是探索人群中HAstV分子流行病学特征的有效手段。

基于下一代测序的污水中人星状病毒分子流行病学研究

目的了解生活污水中人星状病毒(HAstV)的型别分布及遗传多样性。方法2018年1月—2019年6月在山东省济宁市按季度采集6份生活污水样本,通过阴离子膜吸附洗脱法进行浓缩后,提取核酸,进行ORF2完整编码区的RT-PCR扩增及扩增产物下一代测序,对产生的干净数据使用CLC Genomics Workbench 12.0软件de novo组装后,进行基因定型、同源性比较和系统发生学分析。结果检测地区生活污水中HAstV的检出率为100%,共获得HAstV序列43条,分属9种基因型,分别为HAstV-1、HAstV-2、HAstV-3、HAstV-4、HAstV-5等经典型和MLB1、VA1、VA2、VA3等新型HAstV,其中HAstV-5(47.53%)占比最高;基于ORF2完整编码区的系统发生学显示山东株与国内外其他参考株在一些分支上聚集在一起,表明不同型别在世界不同地区的传播。结论本研究证实了基于NGS的环境监测有助于提高对HAstV遗传多样性的认识。

山东省2020—2021年蚊虫中乙型脑炎病毒感染率及系统进化分析

目的了解山东省蚊虫中流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的感染情况、基因型及遗传变异特征,为流行性乙型脑炎的防控提供科学依据。方法分别于2020年8月和2021年8月在山东省济宁市微山县、临沂市莒南县、东营市垦利区采用紫外诱蚊灯和电动吸蚊器采集蚊虫标本。对蚊虫标本进行研磨,使用实时荧光定量PCR方法检测蚊虫标本中的JEV,采用最大似然法对蚊虫中JEV感染率及其95%可信区间进行估算。将JEV阳性标本进行E基因和PrM基因的RT-PCR扩增及测序,并使用Bioedit 7.0和Mega 11等软件进行序列分析。结果2年2次共采集蚊虫6种737批37455只,其中三带喙库蚊为优势蚊种31452只(83.97%),其次为骚扰阿蚊2508只(6.70%)、中华按蚊2468只(6.59%)、淡色库蚊970只(2.59%)、伊蚊40只(0.11%)和二帯喙库蚊17只(0.04%)。将所有蚊虫分为737批进行检测,其中53批JEV核酸阳性,2020年和2021年山东省监测点蚊虫JEV总体感染率分别为0.19%(0.13%,0.26%)和0.14%(0.09%,0.22%),按地区分布JEV感染率最高的是微山2020年采集的蚊虫,达0.84%(0.51%,1.33%)。基于E基因和PrM基因的系统进化分析表明山东JEV序列均属于基因1型G1-b亚型,但属于多个不同的小分支谱系。结论山东省近年蚊虫感染基因1型JEV,不同地区的蚊虫中JEV感染率差异较大。蚊虫中JEV的持续存在凸显了保持乙脑疫苗高接种率的重要性。

肠道病毒A组山东地方株的基因型分布

为研究肠道病毒A组山东地方株的基因型及分子进化特征,本研究采集1998-2008年急性弛缓性麻痹（AFP）患者及2008年和2009年手足口病（HFMD）患者粪便标本,进行肠道病毒分离。来自HFMD病例的阳性病毒分离物进行肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CVA16）特异性逆转录-聚合酶链反应鉴定,随即选取部分阳性分离株进行VP1完整编码区核苷酸序列测定和分析。EV71和CVA16特异性引物阴性者以及来自AFP病例的阳性病毒分离物采用A组肠道病毒特异性引物进行VP1完整编码区核苷酸序列测定。所获得序列与其他A组各基因型代表株进行比较并构建系统发生树。共获得293株肠道病毒A组山东地方株,分别属于CVA4、CVA5、CVA10、CVA14、CVA16、EV71、EV76、EV90共8个基因型。各基因型内山东地方分离株跟原型株相比基因序列同源性较低,系统发生学分析显示肠道病毒A组山东地方株各血清型中与原型株亲缘关系较远,提示山东省存在不同基因特征的A组肠道病毒传播。

人类肠道病毒B组73、75和97型山东地方株的鉴定及其基因特征分析

本研究对3例急性弛缓性麻痹患者标本的阳性病毒分离物进行了分子生物学定型。按照文献报道的方法,用扩增人类肠道病毒(Human Enterovirus,HEV)VP1完整编码区通用引物008-013、011-012进行逆转录-聚合酶链反应,反应产物纯化后进行序列测定。所得序列通过BLAST程序进行基因定型,显示3株病毒分别为HEV B组中新型病毒HEV73、HEV75和HEV97。将获得的序列与GenBank数据库中已有的各型病毒株VP1基因序列进行同源性分析并构建系统发生树,结果显示与各自的原型株相比有较大的变异,提示本次发现的HEV B组73、75、97型山东地方株与各型原型株相比具有不同的基因特征,这是在国内首次发现HEV97。

人类肠道病毒74、80和87型山东地方株的鉴定及基因特征分析

随着基于VP1序列分析的分子定型方法的推广应用,许多新型人类肠道病毒(Human enterovirus,HEV)陆续被发现。本研究通过对1989～2010年山东省急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis,AFP)监测系统分离到的非脊髓灰质炎肠道病毒进行VP1完整编码区的序列扩增及分子定型,共发现1株EV74,3株EV80和1株EV87。同源性分析显示EV74、EV80和EV87山东分离株与原型株的核苷酸同源性分别为81.4%,76.4%～81.7%以及80.3%。系统发生学分析显示山东地方株与国内外其他分离株的亲缘关系均较远。这是在中国大陆地区首次发现EV74和EV87,其中EV87山东分离株为全球第2个鉴定出的分离株。这3种新型HEV在AFP监测系统中的分离率较低,提示尚未在我国导致大规模流行。

2011年济南市某污水河中肠道病毒的分离鉴定与序列分析

目的：监测济南市区地表河水中的人类肠道病毒（HEV），分析其基因特征。方法于2011年5、6、7月份对流经济南市中心城区的西泺河各采集1份河水标本，经过阴离子膜吸附的方法浓缩后，接种RD、HEp-2和L20b细胞进行病毒分离。测定分离株VP1编码区序列并进行序列分析。结果共分离到HEV 9株，其中埃可病毒6型（Echovirus 6，E6）4株，柯萨奇B2病毒（Coxsackievirus B2，CVB2）5株。VP1核苷酸序列分析显示，4株E6病毒与2010年山东省临沂市脑膜炎病例分离株的同源性较高（95．9％～96．7％），提示当地有发生E6引起的脑膜炎病例的可能性；与济南市2010年污水分离株的同源性为94．5％～99．7％。5株CVB2病毒之间有较高的核苷酸同源性（98．4％～100％），与往年山东省急性弛缓性麻痹病例分离株之间同源性为80．9％～95．2％。结论生活污水的排入河可作为HEV环境监测的采样点，我国无专门HEV病例监测系统，环境监测是了解一个地区HEV流行的重要途径。