基于线粒体DNA和核DNA遗传标记的中华鲟种属鉴定

目的 构建一种基于线粒体DNA和核DNA遗传标记的中华鲟及其潜在杂交种的鉴定方法。方法 根据美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)已公布的中华鲟cytb基因序列设计引物,并选用鲟鱼单拷贝核基因fam43a扩增引物对中华鲟DNA进行扩增与测序,其中对fam43a基因扩增产物进行TA克隆测序。通过BLAST序列相似性检索确定样本来源,并基于邻接法构建鲟形目系统进化树。结果 中华鲟样本测序所得cytb和fam43a基因序列长度分别为728 bp和730 bp,且10个克隆群所测fam43a基因序列完全一致。基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool, BLAST)序列相似分析显示,所测cytb与fam43a基因序列均与GenBank数据库中的中华鲟相似性最高,相似性分别为99.86%和100%。系统进化分析显示,中华鲟样本所测得序列均与GenBank数据库中的中华鲟DNA序列聚类在一起,且与鲟形目其他物种位于不同分支。结论 联合使用线粒体DNA和核DNA遗传标记能够快速准确地鉴定中华鲟及其潜在杂交种,该方法能够满足法医日常检案的鉴定需求,为中华鲟的拯救和保护提供科学技术支持。

鉴别6种常见食用肉类的多重PCR检测体系的构建及验证

目的建立一种快速、准确、灵敏的多重PCR检测方法,用于同时鉴别6种常见食用肉类(牛、羊、鸡、猪、鹅、鸭),并评估其在肉类食品掺假鉴定中的应用价值。方法基于GenBank数据库中6个物种的线粒体全基因组序列,筛选具有种内保守性、种间特异性的DNA序列(牛16S rRNA、羊COX-1、鸡Cytb、猪COX-1、鹅NADH2、鸭16S rRNA),并设计物种特异性引物,以此构建一个可同时鉴别6种常见食用肉类的多重PCR检测体系。对该体系进行种属特异性、灵敏度和重复性研究,并进行模拟混合样品检测。结果成功构建了一个可同时鉴别6种常见食用肉类的多重PCR检测体系,该体系在非目标物种的DNA中均未有效扩增;在DNA模板量为0.0625~2ng/μL时,6个物种的扩增产物均能检见。在鸭肉和牛肉混合比例低至0.5%时,仍能检测到鸭肉成分。结论本研究构建了一个特异性强、灵敏度高、重复性好的多重PCR检测体系,可准确鉴别6种常见食用肉类食品中的动物源性成分,为我国常见食用肉类及肉制品的掺假鉴定提供了一种简单、实用的检测技术。

应用SNaPshot技术检测精液特异性cSNP遗传标记

目的探讨基于SNaPshot技术的精液特异性编码区单核苷酸多态性(coding region single nucleo⁃tide polymorphism,cSNP)遗传标记检测在精液(斑)溯源及混合体液(斑)鉴定中的可行性。方法制备16例精液斑和11例精液-静脉血混合斑样本,提取其基因组DNA(genomic DNA,gDNA)和总RNA,并将总RNA逆转录为互补DNA(complementary DNA,cDNA)。在已验证的精液特异性mRNA编码基因上筛选cSNP遗传标记。基于SNaPshot技术构建cSNP复合检测体系并通过CE对样本进行基因分型。结果成功构建了包含5个精液特异性cSNP的复合检测体系。在16例精液样本中,除了位于TGM4基因上的cSNP在cDNA的检测结果中出现等位基因丢失外,其余cSNP的gDNA和cDNA分型结果高度一致。检测精液-静脉血混合斑时,检出的cSNP分型结果均与精液提供者的基因型一致,未受到静脉血提供者基因型的干扰。结论应用SNaPshot技术检测精液特异性cSNP的方法可以应用于法医学精液(斑)的基因分型,并为混合体液(斑)中精液来源个体的判定提供信息。

不同部位骨骼预处理及DNA提取方法的比较研究

目的比较不同部位骨骼预处理及脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取方法,以期确定骨骼DNA最优提取流程。方法先收集一头家养牛的新鲜骨样本,包括股骨、肱骨和肋骨各一根,采用球磨法和冷冻研磨法制备骨粉,利用AutoMate ExpressTM磁珠法等5种方法提取DNA,并运用配对t检验和单因素方差分析比较不同提取方法下DNA质量浓度、纯度和短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分型结果。结果在产量方面,球磨法具有较大优势,利用AutoMate ExpressTM磁珠法提取的DNA质量浓度最高;在纯度方面,2种预处理方法无显著性差异,AutoMate ExpressTM磁珠法提取的DNA纯度最高;在STR检测方面,冷冻研磨法结合AutoMate ExpressTM磁珠法可获得较好的STR分型结果及基因座检出率。此外,肋骨更可能获得最佳DNA产量和STR检测结果。结论冷冻研磨法是一种更为理想的骨骼预处理方法,在此基础上结合AutoMate ExpressTM磁珠法可极大提高骨骼DNA回收率。此外,肋骨更适用于骨骼DNA鉴定实践。

骨骼DNA提取与检测的法医学研究进展

骨骼DNA提取与检测是大规模灾难受害者、失踪人员以及刑事案件法医DNA鉴定过程的重要组成部分。骨骼的部位、类型以及温度、湿度、微生物、酸碱度等因素都会影响骨骼中DNA的“质”和“量”,从而影响检测的准确性。随着科技的发展,短串联重复序列基因座、DNA检测试剂盒以及单核苷酸多态性技术、线粒体DNA检测技术不断进步,提高了骨骼DNA的提取与检测的成功率。因此,了解影响DNA提取与检测的骨骼类型以及环境因素,选取适当的检测方法和手段显得尤为重要,通过重点综述影响骨骼DNA质量的环境因素以及骨骼DNA提取与检测手段的研究进展,以期为法医学领域使用骨骼作为检材时遇到的问题提供指导。

利用人体皮肤及口腔微生物群进行地理溯源

目的 通过对细菌16S rRNA基因全长的测序分析,探究利用人类皮肤及口腔微生物推断个体地理位置来源的可能性。方法 提取上海和内蒙古赤峰两地汉族人群手掌及口腔微生物DNA,通过16S rRNA基因全长测序,分析两地人群微生物群组成和多样性情况,随后筛选差异性物种并构建地理位置预测模型。结果 上海与赤峰两地汉族人群手掌侧皮肤及口腔微生物的组成结构均不相同。对于手掌侧皮肤微生物,赤峰样本的丰富度和均匀度均高于上海样本,而口腔微生物的差异则不显著。置换多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA)证实两地样本的β多样性差异具有统计学意义,皮肤样本与口腔样本的决定系数(R~2)分别为0.129和0.102。通过主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)可以对两地样本进行初步区分。预测模型利用皮肤和口腔样本对地理来源进行预测的准确率分别为0.90和0.83。结论 上海和赤峰两地汉族人群手掌侧皮肤和口腔微生物的结构均存在差异,利用随机森林算法构建的预测模型可以对来自以上两地的未知个体进行溯源。

大规模平行测序技术在STR遗传标记检测中的应用进展

近年来,越来越多的法医遗传学实验室着手应用大规模平行测序(massively parallel sequencing,MPS)技术,即二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术,检测包括短串联重复序列(short tandem repeat,STR)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)在内的常用法医学遗传标记,以及线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)控制区或全序列和信使RNA(messenger RNA,mRNA)等,用于个体识别、亲缘关系鉴定、祖源推断和体液识别等法医学实践。其中,STR作为法医遗传学中使用范围最广的遗传标记,目前主要应用毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)平台检测。与该平台相比,MPS技术具有能够同时检测大量遗传标记、多样本并行检测、测得序列多态性使STR具有更高的分辨能力和系统效能等优势。然而,MPS检测技术花费较大,尚未有统一的使用规范,以及存在如何整合MPS-STR数据与现存CE-STR数据库等难题。本文总结了法医遗传学领域应用MPS技术进行STR遗传标记检测的研究现状,提出了目前亟待解决的主要问题,并对该技术在本领域中的应用前景进行了展望。

二代测序技术在Y染色体遗传标记分型中的法医学应用

法医遗传学领域常利用Y染色体的父系遗传特点,对非重组区遗传标记进行检测并用于亲缘关系鉴定、混合斑检测、家系排查以及种族推断等研究。目前毛细管电泳仍是应用最为广泛的检测技术,基于该技术的商业化检测试剂盒及数据分析处理系统十分成熟。随着生物信息量的增长,传统检测技术通量低的弊端逐渐显现,推动了法医DNA分型技术的革新。近年来,二代测序(next generation sequencing,NGS)技术发展迅速,其应用已被推广到包括法医遗传学在内的各领域,为Y染色体遗传标记的检测提供了新的技术手段。本文就NGS技术应用于法医学Y染色体遗传标记检测的研究现况和应用前景进行阐述,以期为后续司法实务提供新思路。

新疆维吾尔族人群16个X-STR基因座的遗传多态性

目的研究新疆维吾尔族人群16个X-STR基因座的遗传多态性和群体遗传学参数。方法应用Goldeneye®DNA身份鉴定系统17X对502例(女性251例,男性251例)新疆维吾尔族无关个体进行16个X-STR基因座的复合扩增,应用3130xl基因分析仪对扩增产物进行检测,并统计等位基因频率及群体遗传学参数,计算维吾尔族与其他8个人群间的遗传距离,并根据遗传距离进行多维尺度分析以及系统发育树的构建。结果在502例新疆维吾尔族无关个体中,所检测的16个X-STR基因座共观察到67个等位基因,等位基因频率为0.0013~0.5724,PIC为0.5688~0.8553,女性CDP为0.999999999999999,男性CDP为0.999999999743071,三联体累积平均非父排除率为0.999999997791859,二联体累积平均非父排除率为0.999998989000730。维吾尔族人群与哈萨克族人群遗传距离较近,与汉族人群遗传距离较远。结论该16个X-STR基因座在维吾尔族人群中具有高度的多态性和较好的鉴别能力,可为该人群的法医学个体识别、亲权鉴定和群体遗传学研究提供有力的补充。

SifaInDel 45plex体系在我国汉族和蒙古族人群中的应用

目的 调查SifaInDel 45plex体系所含InDel位点在我国江苏汉族和内蒙古蒙古族人群中的遗传多态性,并评估该体系的法医学应用效能。方法 应用SifaInDel 45plex体系对上述2个民族共398名无关个体血样进行等位基因分型检测,分别计算2个研究人群的等位基因频率和群体遗传学参数;以gnomAD数据库中8个不同洲际人群为参考群体,基于27个常染色体InDel位点的等位基因频率,计算2个研究人群与8个参考人群间的遗传距离,并构建系统发育树和多维尺度分析图。结果 2个研究人群中,27个常染色体InDel、16个X染色体InDel位点间均不存在连锁不平衡,等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。27个常染色体InDel位点在2个研究人群中的CDP均高于0.999 999 999 9,CPE_(trio)均小于0.999 9。16个X染色体InDel位点在江苏汉族和内蒙古蒙古族女性群体和男性群体中的CDP分别为0.999 997 962、0.999 998 389和0.999 818 940、0.999 856 063,CMEC_(trio)均小于0.999 9。群体遗传学研究结果表明,江苏汉族、内蒙古蒙古族与东亚人群间遗传关系较近,聚为一支;其他7个洲际人群聚为另一支;上述3个人群与其他7个洲际人群间遗传关系较远。结论 SifaInDel 45plex体系中的遗传标记在本研究2个民族人群中具有良好的遗传多态性,可用于法医学个体识别或作为亲权鉴定的有效补充,并可用于区分不同洲际人群。

RNA表达分析在法医学体液斑鉴定中的应用与展望

在法医物证鉴定中,准确识别犯罪现场获取的生物样本来源个体及其体液构成对于犯罪性质的明确具有十分关键的作用。近年来,RNA表达分析已成为国际法医学领域发展最快的体液斑鉴定方法之一。由于具有组织或体液特异性表达的特征,多种类型的RNA在既往研究中被证明为非常具有应用前景的体液斑鉴定候选分子标记。本文简要综述了近年来RNA分子标记在体液斑鉴定领域的研究进展,包括目前研究中已得到有效验证的RNA分子标记及其优缺点,并对RNA分子标记在法医学领域的应用前景进行了展望。

ForenSeq^(TM) DNA Signature Prep试剂盒在浙江畲族人群中的法医学应用

目的评估ForenSeq^(TM) DNA Signature Prep试剂盒(以下简称ForenSeq试剂盒)对浙江畲族人群STR序列的解读能力及法医学应用效能。方法应用MiSeq FGx法医基因组学系统和ForenSeq试剂盒对50例浙江畲族人群样本进行大规模平行测序(massively parallel sequencing,MPS)检测,采用ForenSeq^(TM)通用分析软件分析测序数据,获取58个STR基因座的分型结果及序列结构信息。将MPS与PCR-CE技术的分型结果进行一致性比对,并计算等位基因频率和群体遗传学参数。结果在50例浙江畲族人群样本中,共观察到448种序列多态性等位基因,与PCR-CE技术检测的片段长度多态性结果相比,基于ForenSeq试剂盒的MPS检测增加了82个等位基因,在6个基因座的侧翼区共发现7个SNP变异。22例男性的24个Y染色体STR基因座中共检测到19种单倍型。27个常染色体STR基因座的累积个体识别率为1-8.87×10^(-30),累积二联体非父排除率为0.999999962640657,累积三联体非父排除率为0.999999999999633。结论基于MiSeq FGx法医基因组学系统使用ForenSeq试剂盒进行MPS检测,极大提高了检测效能。58个STR基因座在所调查的浙江畲族人群中具有良好的遗传多态性,可应用于法医学个体识别和亲权鉴定。

冻存器官和甲醛固定石蜡包埋组织中RNA的定量表达

目的定量分析并对比冻存器官和甲醛固定石蜡包埋(formaldehyde-fixed and paraffin-embedded,FFPE)组织中核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)的表达情况。方法选取不同死亡时间人体脑、心肌和肝组织的冻存及FFPE样本,提取并检测RNA质量浓度,运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术分析各RNA指标的扩增效率及相对表达量。结果与冻存样本相比,FFPE样本中所提取RNA的质量浓度和完整性相对较低。各RNA指标扩增效率与RNA种类及扩增产物长度有关,其中扩增产物较长的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)及β-肌动蛋白(β-actin,ACTB)扩增效率不理想,而5S核糖体RNA(5Sribosomal RNA,5S rRNA)扩增效率理想且在各组织中表达稳定,故选为内参指标。较长死亡时间的冻存样本及FFPE样本中扩增产物较长的GAPDH及ACTB表达量下降,而组织特异性微小RNA(microRNA,miRNA)以及扩增产物较短的GAPDH和ACTB在同一组织冻存和FFPE样本中表达具有一致性。结论通过标准化RT-qPCR实验,选取合适的RNA指标及设计合适产物长度的引物,能够准确定量FFPE样本中RNA的表达水平。

猫STR基因座复合扩增体系的构建及其法医学应用

目的构建一个猫STR基因座复合扩增体系并对其技术性能进行测试,评估其应用价值。方法整理和分析猫STR基因座文献数据资料,筛选可用于猫个体识别和亲缘关系鉴定的STR基因座和性别鉴定位点,设计荧光标记引物,构建复合扩增体系。对构建的复合扩增体系进行灵敏度、准确性、均衡性、稳定性、种属特异性、组织同一性和混合样本等验证,并对145例猫无关个体进行群体遗传学调查。结果成功筛选到16个猫常染色体STR基因座和1个Y染色体性别决定区,并构建了包含上述基因座的复合扩增体系。DNA模板量低至0.25 ng时仍可得到完整分型,检测其他常见动物样本时未见特异性扩增峰。群体遗传学调查结果显示,16个猫STR基因座累积个体识别率为1-3.57×10^(-20),累积非父排除率为1-6.35×10^(-5),累积匹配概率为3.61×10^(-20)。结论本研究构建的猫STR基因座复合扩增体系灵敏度高、种属特异性好、分型结果准确,能够为司法鉴定领域中涉及猫的种属鉴定、个体识别及亲缘关系鉴定等案件提供有效的解决方法。

大麻遗传标记的法医学应用研究进展

大麻是大麻科大麻属一年生雌雄异株的草本植物,其内含有具有强烈成瘾性和麻醉性的四氢大麻酚(THC)。大麻价格低廉、获取方便、且受到一些国家和地区合法化的影响,目前已成为滥用最广泛的毒品之一。因此,大麻植株的鉴定对于打击毒品犯罪、维护社会稳定具有重要意义。近年来,基于DNA遗传标记的大麻鉴定为案件侦破提供了新的技术手段,针对已报道的大麻遗传标记,如序列特异性扩增区(Sequence-Characterized Amplified Region,SCAR)、DNA条形码(DNA Barcoding)、短串联重复序列(Short Tandem Repeats,STR)和单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)及其应用进行综述,旨在为司法鉴定和法庭科学中大麻的种属鉴定、个体识别及来源地推断等应用提供理论依据。

基因索源,保护生灵——DNA物种鉴定

019年8月,上海市渔政执法人员在巡逻时查到一艘非法捕捞渔船,发现其所捕的鱼中有一条疑似中华。中华是国家一级保护动物,被誉为“水中熊猫”。这条鱼是不是中华鲟,对该案十分重要。因为对涉及野生动植物的犯罪,只有明确野生动植物的种属才能确定其保护级别,形成完整的证据链,从而对犯罪分子进行定罪、量刑。司法鉴定科学研究院接受执法机关的委托,采用形态学方法和DNA技术进行鉴定,最后确认其为中华。

牛的13个STR基因座复合扩增体系的构建及法医学验证

目的构建一套适用于牛进行个体识别和亲子鉴定的STR基因座复合扩增体系,并对其法医学应用性能进行评估。方法基于数据库筛选了13个多态性牛STR基因座(TGLA126、BT66、BT165、ETH10、CSSM0113、INRA005、BT54、BT61、INRA023、BM2113、G18833、UMN0929、INRA063),构建了5色荧光复合扩增体系。对复合扩增体系进行了灵敏度、准确性、均衡性、稳定性、种属特异性、组织同一性和混合样本等验证,并在96例牛无关个体样本中进行了群体遗传学调查。结果本研究成功构建了一套包含13个多态牛STR基因座的复合扩增体系,该体系灵敏度达125pg,检测同一个体的不同组织、重复检测样本均得到一致的分型结果,检测常见动物样本时未见特异性扩增峰,体系可耐受血红素(≤200μM)、腐殖酸(≤150 ng/μL)、尿素(≤24000 ng/μL)、靛蓝(≤5000ng/μL)、黑色素(≤400 ng/μL)等PCR抑制剂。13个STR基因座累计个体识别概率为0.99999999997,累计非父排除概率为0.99992666846。结论本研究构建的STR复合扩增体系分型结果准确、稳定,灵敏度高且特异性良好,可以用于牛的种属鉴定、个体识别和亲子鉴定等相关案件。

应用16S rRNA基因测序鉴定肉类掺假1例

1案例资料1.1简要案情2021年4月,某市群众举报市场内一熟食店存在将猪肉冒充牛肉进行销售的现象。公安机关受理后委托本院对抽样挑选的2块卤制肉进行种属鉴定。1.2鉴定过程1.2.1DNA提取从2块卤制肉中(编号为1号、2号)各剪取20 mg组织,经清洗、消毒后分别放置于1.5 mL离心管中,并按照《法庭科学DNA实验室检验规范》(GA/T 383-2014)采用DNeasy?Blood&Tissue Kit试剂盒(德国Qiagen公司)进行DNA提取。