沙门菌噬菌体溶菌酶LysSHWT1的制备及抑菌活性分析

近年来抗生素的不合理使用导致细菌耐药性问题逐渐加剧,开发新型有效的抗菌制剂迫在眉睫。噬菌体及其溶菌酶具有特异性强、抗菌效力强、安全性高、筛选周期短、绿色安全及不易产生耐药等优势,可作为一种天然抗菌剂防控细菌病。为了分析广宿主谱沙门菌噬菌体SHWT1的溶菌酶抑菌活性,本文将沙门菌裂解性噬菌体SHWT1的溶菌酶lys基因克隆至表达载体pET28a(+),然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,纯化后获得了大小19 kDa、浓度为2 mg/mL的高纯度融合蛋白LysSHWT1。平板裂解实验显示,溶菌酶重组蛋白LysSHWT1对鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡伤寒沙门菌具有较好的裂解活性,裂菌圈直径分别为16、13、14、13 mm,对照组无裂解圈;裂菌谱结果显示,LysSHWT1对101株临床沙门菌株中的60株菌株存在裂解作用,未发现能裂解除沙门菌外的其他菌株;进一步研究发现,溶菌酶在EDTA的协同作用下可以展现更好的抑菌活性,使鸡白痢沙门菌SP01、鸡伤寒沙门菌SG02、鼠伤寒沙门菌SAT52、肠炎沙门菌SE12滴度显著下降(P<0.05)。本研究表明广宿主谱沙门菌噬菌体溶菌酶LysSHWT1可有效裂解沙门菌,在防控沙门菌感染方面具有潜在的应用价值。

双组分系统CpxR影响禽致病性大肠杆菌的耐药性、抗血清杀菌能力及毒力

CpxR是细菌中Cpx双组分系统(two component system, TCS)的反应调控蛋白,通过调控靶基因的转录表达,在细菌细胞膜稳定及毒力方面发挥作用。本研究旨在探究TCS CpxR对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)基本生物学特性、抗血清杀菌能力及致病性的影响。利用Red同源重组系统及互补质粒构建cpxR基因缺失株、互补株,然后比较分析野生株、基因缺失株与互补株的生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、药物敏感性、抗血清杀菌能力、动物致病性的差异。结果显示:cpxR基因缺失株与野生株、互补株的生长速度和运动性能无明显差异,且缺失cpxR基因不影响APEC的生物被膜形成能力。然而,缺失CpxR导致APEC对阿米卡星和卡那霉素耐药性降低。血清杀菌试验结果显示,CpxR有助于APEC的抗血清杀菌能力。动物感染试验结果显示,野生株、cpxR基因缺失株和互补株对雏鸭的半数致死量(LD_(50))分别为7.50×10^(5)、7.50×10^(6)、1.33×10^(6) CFU,表明CpxR缺失显著降低APEC的毒力。综上表明,TCS CpxR在APEC耐药性、抗血清杀菌能力及毒力方面发挥作用,为阐明APEC的环境适应性、生存能力及致病机制提供参考。

广西地区鸡胚中沙门菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解广西地区鸡胚中沙门菌的流行情况及耐药现状,本研究对广西某些鸡场送检的病死鸡胚进行沙门菌的分离鉴定。然后利用PCR方法鉴定沙门菌临床分离株的血清型及毒力因子,并检测其耐药性。结果显示,经选择性培养基和PCR鉴定分离到18株沙门菌,分离率为13.95%(18/129)。血清型鉴定显示:分离株均为鸡白痢沙门菌。毒力基因检测发现shdA基因的分布率只有22.22%,其余15个毒力基因的分布率均为100%。药敏试验结果显示,沙门菌分离株对卡那霉素、庆大霉素、氯霉素、美罗培南、亚胺培南均敏感;但对林可霉素、克林霉素、罗红霉素、红霉素、利福平的耐药率达100%,表明鸡白痢沙门菌的多重耐药现象严重。本研究提示鸡白痢可能是导致鸡胚死亡及孵化率低的原因,因此应严格进行鸡白痢的防控净化工作。

常见耐药基因多重PCR方法的建立及用于禽致病性大肠杆菌耐药性监测

本研究旨在建立β-内酰胺类、四环素类、氨基苷类、酰胺醇类、磺胺类抗菌药物耐药基因的多重PCR检测方法,用于耐药基因的快速检测。根据GenBank公布的上述5类抗菌药物的耐药基因序列,设计17对特异性引物。通过优化PCR体系和反应程序,建立4组耐药基因(cat+floR+tetB+tetC;dfrA 12+sul 2+sul 1+bla CTX-M+bal TEM-1;aac 3+aph 3+aadA 1+strB;tetA+cmlA+strA+sul 3)的多重PCR反应体系。然后,检测多重PCR方法的特异性和敏感性。利用建立的多重PCR方法检测42株禽致病性大肠杆菌的耐药基因,同时,检测其耐药性,比较分析耐药基因和耐药表型之间的相关性。结果显示,建立的4组多重PCR体系可有效扩增出17个耐药基因片段,测序结果表明特异性较好。敏感性结果表明,4组多重PCR体系的菌液敏感性分别为103、104、104和105 CFU。禽致病性大肠杆菌分离株的耐药基因多重PCR和单重PCR检测结果一致,其携带的耐药基因和耐药表型的符合率为92.86%。本研究建立的耐药基因多重PCR方法能简便、快速地检测常见的耐药基因,可用于耐药基因的传播、流行调查。

噬菌体疗法预防细菌性感染的研究进展及发展方向

由于抗生素的不合理使用,引起了细菌多重耐药性、药物残留、食品安全、环境菌群不平衡等问题,严重威胁人类及动物的健康。因此,寻找新型抗菌药物及治疗方案已成为当前的研究重点。噬菌体是感染细菌、真菌等微生物的病毒,自发现伊始便用于治疗细菌感染。与传统抗生素相比,噬菌体具有分布广、易筛选、高度的宿主专一性、增殖能力强、安全性高、研发成本低等优势。随着多重耐药菌的广泛流行,噬菌体治疗细菌感染重新引起了人们的重视。本文简述了噬菌体的生物学特性、噬菌体疗法在预防细菌感染的应用及噬菌体研究发展方向,以期为噬菌体疗法预防细菌性感染提供参考。

禽致病性大肠杆菌血清型、进化分群及毒力基因的分子流行病学调查

为了解禽致病性大肠杆菌(APEC)的分子流行特点,从华东等地区分离鉴定210株APEC菌株,然后检测其血清型、系统进化分群及毒力基因,并分析毒力因子与血清型、系统进化分群之间的关联性。血清型检测结果显示,O78、O1、O2为流行血清型。通过系统进化分群分析发现A、B1、B2及D群比例分别为21.90%、20.00%、31.90%、21.90%。毒力基因检测结果显示,fimC、mat及ibeB基因检出率为90%以上,papC、neuC、vat、ibeA检出率低于22%,且所有分离株至少含有4个毒力基因。关联分析发现,毒力基因irp2、ibeA、neuC、vat及ETT2在特定血清型中的分布较高,而papC、tsh、irp2、neuC、vat及ibeA在B2进化分群较高。结果表明,华东等地区APEC携带多种毒力基因,毒力基因分布与特定血清型及系统进化分群具有关联性,为了解当地的APEC优势流行菌株及防控提供了参考。

鉴别大肠杆菌O_(8)/O_(9)血清型双重PCR方法的建立

为了建立一种能鉴定大肠杆菌O8、O9血清型的高效、快速的双重PCR方法,参考Gen Bank中大肠杆菌O8、O9血清型的O抗原合成基因簇序列筛选特异性靶标基因并设计合成2对PCR引物,通过优化反应条件,分析双重PCR方法的特异性、敏感性,通过检测大肠杆菌临床分离株验证双重PCR的实用性。结果显示,所建立的双重PCR方法可有效鉴定O8、O9血清型大肠杆菌,对其他血清型大肠杆菌及菌株则无交叉反应,表明PCR方法的特异性好;O8和O9血清型的菌体最低检出限分别为1×10^(3)CFU/m L和1×10^(4)CFU/m L,其DNA最低检出限分别为10 pg/μL和500 pg/μL。临床分离菌株检测显示,双重PCR检测结果与传统血清凝集结果一致。结果表明,本研究建立的双重PCR方法可有效、特异、灵敏、快速鉴定大肠杆菌O8、O9血清型,为大肠杆菌O8、O9血清型检测及其流行病学调查提供了新的技术手段。