基因表达谱分析非酒精性脂肪性肝病中谷胱甘肽转移酶的作用

目的用二代转录组测序(RNA-seq)技术,结合差异基因GO分析、KEGG富集分析,探讨谷胱甘肽转移酶(GST)在高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中的作用。方法14只雄性C57BL/6J小鼠随机抽样分为对照组(n=6)和模型组(n=8)。对照组小鼠喂养普通饲料;模型组喂养高脂饲料,连续7周,构建NAFLD模型。试剂盒检测血清ALT、AST活性及TG水平、苏木精-伊红(HE)和油红染色观察肝组织病理和脂滴沉积情况;提取肝组织RNA进行高通量转录组测序,将基因表达量差异倍数≥2.0且P<0.05定义为差异基因,筛选对照组与模型组肝组织差异基因,应用GO、KEGG数据库进行功能分析,并采用qRT-PCR验证差异基因表达。符合正态分布的计量资料两组比较采用独立样本t检验。结果对照组与模型组小鼠体质量、血清ALT、AST差异无统计学意义(P值均>0.05)。与对照组相比,模型组血清TG水平明显高于对照组[(2.02±0.50)mmol/L vs(1.00±0.29)mmol/L,t=-4.45,P=0.001]。HE染色提示:模型组可见弥漫性脂肪变性和气球样变。油红染色显示:模型组肝细胞胞浆内橘红色脂滴明显增多,且肝细胞脂肪变分级明显高于对照组(1.88±0.64 vs 1.00±0.00,t=-3.86,P=0.006)。转录组测序提示两组差异基因1367个,其中上调基因数608个、下调基因数759个;且两组中GST基因差异表达17个。选择差异倍数最明显的前10个GST基因进行验证。与对照组相比,GSTa2、GSTa3、GSTa4、GSTm1、GSTm2、GSTm3、GSTm4、GSTp1、GSTo1表达下调,GSTk1表达上调。实验结果与测序结果一致。结论GST通过参与类固醇代谢过程、脂肪酸代谢过程、胆固醇代谢过程等多个生物学过程影响脂质代谢,与NAFLD发病密切相关。

扶正化瘀方对肝硬化小鼠模型肝细胞消亡与再生的影响

目的探讨扶正化瘀方对纤维化肝脏肝细胞消亡与再生的影响,及其药物促进肝细胞再生的作用机制。方法以CCl4腹腔注射6周诱导建立肝硬化小鼠模型。正常对照组9只,模型组10只,索拉非尼组10只,扶正化瘀方组10只。自造模第4周起,扶正化瘀方组、索拉非尼组分别给予4.8 g/kg、4 mg/kg小鼠体质量相应药物灌胃,连续3周;正常组和模型组给予等体积羧甲基纤维素钠。检测血清肝功能;METAVIR评分系统评价肝组织炎症及纤维化分期;天狼星红染色和肝组织羟脯氨酸含量评价胶原沉积量;免疫组化检测Ⅳ型胶原、CD31与CD32b、Ki67、CyclinD1、谷氨酰胺合成酶(GS)、Wnt2以及HGF蛋白的表达;Western Blot检测肝组织Wnt2、LRP6、β-catenin、p-β-catenin、CyclinD1表达。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果与模型组比较,扶正化瘀方组和索拉非尼组血清ALT、AST水平和肝组织羟脯氨酸含量均降低(P值均<0.01),METAVIR评分减低(P值均<0.05);Ⅳ型胶原、CD31表达减少(P值均<0.05),CD32b表达增加(P<0.01);肝组织实质病变消亡数量减少,Ki67、CyclinD1表达上升(P值均<0.01);Wnt2、LRP6、β-catenin、CyclinD1蛋白表达水平上调、p-β-catenin表达显著下调(P值均<0.05);肝组织CD32b与Wnt2共染阳性细胞显著增多。结论扶正化瘀方可通过抑制肝窦毛细血管化,改善肝窦内皮细胞Wnt2外分泌功能,激活肝细胞再生相关Wnt/β-catenin信号通路,最终逆转肝硬化。

虫草菌丝调节AMPK/SirT1信号通路对四氯化碳诱导肝纤维化小鼠的作用

目的研究虫草菌丝(cultured mycelium Cordyceps sinensis,CMCS)对四氯化碳(CCl4)诱导肝纤维化模型小鼠肝腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1(AMPK/SirT1)信号通路的作用机制。方法将C57BL/6小鼠(n=40)按体重分层随机分为5组:正常对照组、CMCS对照组(3.0 g/kg)、模型对照组、CMCS 1.5 g/kg组(1.5 g/kg)和CMCS 3.0 g/kg组(3.0 g/kg),采用腹腔注射10%CCl4(2 mL/kg)诱导小鼠肝损伤模型。造模与给药2周后,检测血清ALT、AST、TBil水平;苏木素-伊红(HE)染色观察肝炎症;天狼星红染色观察肝胶原沉积;Jamall’s法检测肝羟脯氨酸(Hyp)含量;流式蛋白定量技术(cytometric bead array,CBA)检测肝组织IL-6、MCP-1、IFN-γ、TNF、IL-10、IL-12p70水平;免疫组化观察肝组织CollagenⅠ和SirT1表达情况;RT-qPCR检测肝组织Prkaa1、Prkaa2、Lkb1和p53水平。结果CCl4染毒2周后,模型对照组血清ALT、AST、TBil水平均明显升高(P<0.05);HE染色和天狼星红染色分别提示肝内大量炎症细胞浸润和胶原沉积;肝Hyp含量及IL-6、MCP-1、TNF表达明显增多(P<0.05),IL-10和IL-12p70表达明显减少(P<0.01);免疫组化染色提示肝组织Collagen I表达增多;SirT1在肝窦间隙表达减少,在胶原沉积处表达增多;RT-qPCR检测提示肝组织Prkaa1、Prkaa2、Lkb1表达下降,p53表达增多(P<0.05)。CMCS可显著降低纤维化小鼠血清ALT、AST水平;降低肝组织IL-6、MCP-1、TNF表达(P<0.05),上调IL-10、IL-12p70水平(P<0.05);减少肝炎细胞浸润、胶原形成和Hyp含量,促进肝窦内SirT1表达,上调肝Prkaa1、Prkaa2、Lkb1表达(P<0.05);减轻肝内CollagenⅠ、p53表达(P<0.05)。与CMCS 1.5 g/kg组相比,CMCS 3.0 g/kg组抑制肝炎症、胶原沉积及上调AMPK/SirT1表达更为明显(P<0.05)。结论CMCS可通过上调AMPK/SirT1信号通路而发挥抗CCl4诱导小鼠肝纤维化的作用。

两种肝毒性化学物诱导的肝纤维化小鼠模型转录组学的比较研究

目的比较四氯化碳(CCl_(4))和3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢可力丁(DDC)两种肝毒性化学物诱导的肝纤维化小鼠模型的转录组学差异,为使用肝纤维化小鼠模型的研究提供参考依据。方法分别采用10%CCl_(4)(2 mL/kg)腹腔注射和0.1%DDC饮食喂养诱导小鼠肝纤维化模型。造模4周后,检测血清ALT、AST、TBil水平;HE染色观察肝内炎症浸润情况;天狼猩红染色观察肝胶原沉积情况;Jamall’s法测定肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量;ELISA检测肝组织上清TNF-α、IL-6和IL-1β含量。提取小鼠总RNA进行测序(RNA-Seq),使用R软件分析2种肝纤维化模型的差异基因,并进行GO和KEGG富集分析,并验证差异显著的基因。结果与正常小鼠相比,CCl_(4)染毒小鼠和DDC饮食小鼠血清ALT、AST、TBil水平和肝组织TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著升高,血清Alb水平下降。病理染色提示CCl_(4)染毒小鼠肝组织结构破坏,中央静脉周围大量肝细胞玻璃样变及坏死;DDC饮食小鼠肝内卟啉沉积,大量炎症细胞在汇管区和胆管周围浸润;两种模型小鼠肝内均有不同程度胶原沉积。通过筛选条件(logFC>2倍且P<0.05)获得CCl_(4)染毒模型、DDC饮食模型的差异基因分别为1820、2373个,其中上调基因分别为1302、1978个,下调基因分别为518、395个。GO注释发现2种模型在分子功能(MF)、生物学过程(BP)、细胞成分(CC)等方面具有重要功能,KEGG分析发现CCl_(4)染毒模型、DDC饮食模型分别激活22、29条信号通路,其中细胞外基质受体的相互作用、细胞周期、蛋白的消化与吸收、焦点粘附、PI3K-Akt等16条信号通路在2种模型中均显著富集(P<0.05)。聚类分析发现在2种模型中均明显下调基因包括Mup11、Mup15、Mup17、Mup1等,采用RT-qPCR得以证实(P<0.05)。结论本研究报道了CCl_(4)染毒和DDC饮食两种肝纤维化模型的RNA-Seq转录组学特点并进行比较,观察基因表达的场所、基因表达所调节的通路等方面,为后续肝纤维化的发病机制和治疗研究的动物模型的选择提供参考依据。

黄芪提取物调节IL-6/STAT3信号通路治疗马兜铃酸Ⅰ诱导肝肾损伤小鼠模型的效果观察

目的探讨黄芪提取物(AR)改善马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ)致小鼠急性肝、肾损伤效果及其调控IL-6/STAT3信号通路的作用机制。方法健康雄性C57BL/6小鼠38只,采用简单随机分组法分为正常组(n=8)、模型组(n=10)、AR组(n=10)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)组(n=10)。模型组小鼠以20 mg/kg AAⅠ腹腔注射,1次/d,持续5 d。正常组小鼠腹腔注射相同容积羧甲基纤维素钠。AR组、NAC组20 mg/kg AAⅠ腹腔注射,1次/d,持续3 d;第4天分别按AR 75 mg/kg、NAC 150 mg/kg小鼠体质量剂量灌胃,1次/d,持续8 d。NAC为阳性对照药。给药造模结束后,处死小鼠并收集血清及肝、肾组织。试剂盒检测血清ALT、AST、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平;HE染色观察肝、肾组织病理;荧光PCR及免疫组化分析肝、肾组织中p-STAT3表达量;酶联免疫吸附实验检测肝、肾组织IL-6、IL-1β及TNF-α表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两组间比较采用SNK-q检验。结果与正常组小鼠相比,模型组小鼠肾体比上升(P<0.05);与模型组相比,AR组ALT、AST、SCr和BUN水平显著降低(F值分别为49.29、31.31、58.89、85.88,P值均<0.01);HE染色结果表明,AR可有效减轻AAⅠ导致的肝、肾组织结构破坏和炎性细胞浸润;荧光PCR及免疫组化染色结果表明,AR可减少肝、肾组织p-STAT3表达;酶联免疫吸附检测发现,AR可下调IL-6、IL-1β及TNF-α表达。NAC与AR效应相似,两者间无明显差异。结论AR对AAⅠ所致急性肝、肾损伤有保护作用,其部分作用机制可能与抑制IL-6/STAT3信号通路激活,减轻炎症反应有关。

中医药对肝硬化门静脉血栓的干预作用及用药特点分析

目的探究中医药对肝硬化合并门静脉血栓(PVT)患者的干预作用及用药特点。方法回顾性选取于上海中医药大学附属曙光医院住院治疗的肝硬化合并PVT患者89例,根据是否联用中医药治疗分为中药组59例,对照组30例。收集两组患者人口学、实验室检查、影像学检查、胃镜检查、手术史、门静脉高压相关并发症、用药情况及随访资料。符合正态分布的计量资料两组间比较采用独立样本t检验;不符合正态分布的计量资料两组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验。计数资料采用χ~2检验或Fisher精确概率法。多因素分析采用有序多分类Logistic回归分析。利用中医传承计算平台V3.0对中药干预处方进行药物效应聚类分析。结果多因素Logistic回归分析显示,食管胃底静脉曲张(OR=3.144,95%CI:1.221~8.094)、PVT范围波及PV+SMV(OR=51.667,95%CI:3.536~754.859)、PV+SV+SMV(OR=13.271,95%CI:2.290~76.928)、伴门静脉海绵样变性(OR=11.896,95%CI:1.172~120.696)及中药干预(OR=0.348,95%CI:0.129~0.938)是肝硬化PVT结局的影响因素(P值均<0.05)。随访结果显示,中药组PVT进展率明显低于对照组(16.95%vs 56.67%,P<0.001)。中药组静脉曲张破裂出血发生率明显低于对照组(8.47%vs 33.33%,P<0.001)。使用频率较高的有效中药为补虚类359次(34.6%)、活血化瘀类202次(19.5%)、利水渗湿类180次(17.3%)等;使用频次较高的中药为黄芪57次(8.7%)、当归50次(7.6%)、水蛭48次(7.3%)等;使用频次较高的药对为黄芪+当归、黄芪+水蛭、当归+水蛭、黄芪+当归+水蛭等。结论黄芪、当归、水蛭等益气活血破血中药可促进肝硬化PVT的稳定或再通,减少门静脉高压出血的发生。

黄芪提取物调节TRPM2表达的抗急性药物性肝损伤作用研究

目的 探讨黄芪提取物(AR)调节TRPM2表达的抗急性DILI作用机制。方法 雄性小鼠39只,随机分为对照组(n=7),对乙酰氨基酚(APAP)模型组,AR低、高剂量组及N-乙酰半胱氨酸(NAC)治疗组,每组各8只。其中AR低、高剂量组分别以50、75 mg/kg的AR灌胃,NAC组以100 mg/kg灌胃,每日1次,共3 d。第4天,除对照组外,其余各组以350 mg/kg剂量APAP灌胃,12 h后处死全部小鼠,收集血清及肝组织。检测血清ALT、AST活性;HE染色观察肝组织病理学变化;免疫组化染色观察肝组织髓过氧化物酶(MPO)、瞬时受体电位M2型离子通道(TRPM2)表达。体外实验以不同剂量APAP(0、5、10、20 mM)孵育AML12细胞12、24 h,筛选出APAP肝细胞损伤最佳浓度和作用时间,并动态检测肝细胞TRPM2基因及蛋白表达。肝细胞分为对照组,模型组,AR低、高剂量组及NAC对照组,除对照组外,其余各组以20 mM APAP诱导损伤,并分别以125、250μg/mL的AR、50 mM NAC孵育24 h。采用CCK8检测细胞活力,qRT-PCR检测肝细胞TRPM2基因表达、Western Blot检测蛋白表达。结果 与对照组比较,APAP可诱导急性DILI,血清ALT、AST活性明显升高(F=35.717、F=18.997,P值均<0.01),肝组织结构破坏严重、肝细胞大块/亚大块坏死、中央静脉淤血;与模型组相比,AR能显著降低模型小鼠血清ALT、AST活性,减轻肝细胞坏死、肝组织MPO及TRPM2表达,具有明显的保肝作用,且AR高剂量组与NAC疗效相当。5 mM APAP孵育AML12细胞24 h明显诱导肝细胞损伤,且肝细胞TRPM2表达随着时间的延长而增加(F=25.408,P<0.01);与模型组相比,AR可提高肝细胞活力、降低肝细胞TRPM2表达。结论 黄芪提取物具有良好的保护APAP诱导急性DILI作用,其机制与抑制TRPM2表达相关。

雷公藤红素治疗非酒精性脂肪性肝病的研究进展

雷公藤红素又名南蛇藤素,为雷公藤根茎的提取物——去甲基木栓烷型三萜类化合物。据报道雷公藤红素有一定肝毒性[1],而更多研究证实其对肝脏具有保护作用,可减轻肝脏炎症[2]、肝损伤[3]和肝纤维化[4],尤其对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)具有治疗作用。NAFLD指除酒精和其他明确肝损害因素外,以肝细胞脂肪变性为主要特征的临床病理综合征,可分为单纯性肝脂肪变和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[5],其发病关键在于高碳水化合物和脂肪酸在代谢过程中产生的脂毒性物质超过肝细胞处理能力,引起肝细胞应激、损伤和/或死亡,出现肝损伤、肝硬化甚至是肝癌[6]。

维生素E抑制氯化汞诱导大鼠肾间质纤维化的抗氧化作用机制(英文)

目的:观察维生素E对氯化汞诱导的大鼠肾间质纤维化的作用并探讨其抗氧化机制方法:32只大鼠随机分为正常组、模型组与维生素E组。除正常组外,其余大鼠以8mg/kg氯化汞(mercuricchloride,HgCl2)灌胃,每天1次,共9周。维生素E组同时以维生素E100mg/kg灌胃,正常组与模型组灌服等量生理盐水。9周后处死大鼠,盐酸水解法检测肾组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,苏木精伊红染色、Masson染色与过碘酸六胺银染色观察肾组织病理形态与胶原沉积;试剂盒方法检测肾组织过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性与谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;蛋白印迹法检测核因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)信号途径的κB抑制蛋白(inhibitorκB,IκB)、磷酸化IκB(phospho-IκB,p-IκB)以及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达;蛋白印迹法与免疫荧光法观察α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。结果:与正常组比较,肾组织Hyp含量、Masson染色与过碘酸六胺银染色以及肾组织α-SMA的变化证实肾间质纤维化模型造模成功;GSH-Px活性与GSH、MDA含量变化提示肾间质纤维化模型存在脂质过氧化损伤。与模型组比较,维生素E组大鼠肾组织Hyp含量降低(P<0.01),肾间质纤维化减轻,GSH与MDA含量降低(P<0.01);维生素E组p-IκB、TNF-α、α-SMA蛋白表达明显降低,各组中IκB蛋白表达无明显变化。结论:维生素E抗氯化汞诱导大鼠肾间质纤维化的作用机制在于抗脂质过氧化损伤,与抑制NF-κB信号通路及细胞外基质产生细胞活化有关。

当归补血汤不同配比组方的抗肝纤维化作用

目的:观察黄芪、当归不同配伍比例(5∶1,1∶1,1∶5)的当归补血汤对大鼠肝纤维化的作用及其对肝脂质过氧化的作用特点。方法:将Wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型组、芪归5∶1方组、芪归1∶1方组、芪归1∶5方组及N-乙酰半胱氨酸对照组(NAC组)。以四氯化碳(CCl4)与高脂低蛋白饮食复合因素诱导大鼠肝纤维化模型,自造模之日起各药物组予灌胃6g/kg相应药物。干预6周后,观察肝组织炎症与脂肪变性及肝组织胶原沉积;测定血清肝功能指标,以及肝组织丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(Hyp)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S转移酶(GST)活性;Western印迹法分析肝组织I型胶原蛋白表达。结果:与正常大鼠比较,模型大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平与总胆红素(TBIL)含量明显升高,白蛋白(Alb)含量明显降低;肝组织脂肪变性与胶原沉积明显,GST活性增强,MDA含量增加,SOD活性降低。各中药配比组均能改善模型大鼠肝组织脂肪变性与胶原病理沉积,降低肝组织Hyp含量,提高血清Alb含量和SOD活性;其中芪归5∶1方组较其他配比组的综合疗效较佳,在改善模型大鼠肝组织脂质过氧化损伤(MDA含量、SOD与GST活性)、抑制肝脏I型胶原表达、改善血清肝功能(ALT水平与TBIL含量)等方面优于其他两种配伍比例组。结论:黄芪当归5∶1,1∶1,1∶5不同配比的当归补血汤均有良好的抗实验性大鼠肝纤维化作用,但以黄芪当归5∶1的经典配比方剂综合效果较好;其作用机制与抗肝脏脂质过氧化损伤有关。

丹酚酸B对NIH/3T3成纤维细胞TGF-β1/ERK胞内信号转导的影响

目的探讨丹酚酸B(SA-B)影响TGF-β1/ERK信号转导的抗肝纤维化作用机制。方法NIH/3T3成纤维细胞常规培养后分为正常组、模型组和治疗组。正常组细胞以含0.5%FBS的M199培养,模型组和治疗组均在相同培养条件下,以100pmol/LTGF-β1刺激24h,治疗组在此基础上再分别以1μmol/LSA-B和10μmol/LSA-B同时温育24h。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力;Western blot法观察细胞TGF-β受体蛋白表达、ERK蛋白表达与磷酸化水平、胞外基质蛋白表达等。结果不同浓度SA-B无明显细胞毒性;TGF-β1刺激明显促进细胞TGF-β受体蛋白表达、ERK磷酸化水平、纤维蛋白酶原激活物抑制因子(PAI-1)与Ⅰ型胶原的蛋白表达,SA-B剂量依赖性抑制TGF-βⅠ型受体(TβR-Ⅰ)的蛋白表达,抑制ERK磷酸化与PAI-1蛋白表达。结论SA-B抑制TGF-β1的胞内ERK信号转导,拮抗TGF-β1的促NIH/3T3成纤维细胞胶原生成可能是SA-B抗肝纤维化的作用机制之一。

转化生长因子β_1与肝纤维化

肝纤维化的形成过程是致病因素（如病毒、寄生虫感染、毒物等）导致肝细胞变性、坏死及炎症反应,激活枯否氏细胞释放一些促纤维化因子（如TGF-β1等）,随同血小板、肝窦内皮细胞和肝细胞等分泌的多种细胞因子,与某些化学介质共同作用于肝星状细胞（Hepatic Stellate Cell.HSC）致使HSC激活,转化为肌成纤维细胞,通过旁分泌或自分泌作用,使HSC增殖、合成大量的细胞外基质（extracellular matrix.ECM）。

扶正化瘀方影响转化生长因子β1/Smad信号通路的抗肝纤维化作用机制

目的:探讨扶正化瘀方影响转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad信号转导的抗肝纤维化作用机制。方法:本研究分体内实验和体外实验两部分。在体内实验中,37只雄性Wistar大鼠分为正常组(5只)、模型组(18只)和扶正化瘀方组(14只)。模型组和扶正化瘀组大鼠采用二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)腹腔注射复制大鼠肝纤维化模型。灌胃治疗4周后,采用盐酸水解法检测肝组织中羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,蛋白质印迹法分析肝组织中TGF-β1、TGF-β1Ⅰ型受体(TGF-β1 type Ⅰ receptor,TβR-Ⅰ)、Smad2、Smad3及磷酸化Smad2/3蛋白的表达。体外实验采用培养4d的原代大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),分为对照组、TGF-β1组、10%扶正化瘀方药物血清组及TβR-Ⅰ胞内激酶抑制剂(SB-431542)组。后3组用2.5ng/mLTGF-β1刺激24h后,对照组及TGF-β1组加10%正常大鼠血清,10%扶正化瘀方药物血清组加10%服用扶正化瘀方的大鼠血清,SB-431542组加10%正常大鼠血清及10μmol/LSB-431542。共孵育24h后,免疫荧光染色检测HSC中α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Smad3蛋白的表达,蛋白质印迹法分析HSC中α-SMA蛋白的表达。结果:体内实验发现,扶正化瘀方可明显降低纤维化肝组织中异常升高的Hyp含量及TGF-β1、TβR-Ⅰ、磷酸化Smad2/3蛋白的表达。体外研究发现,正常HSC中α-SMA、TβR-Ⅰ表达较低,TGF-β1刺激可显著上调其表达;扶正化瘀方药物血清共孵育后,可明显抑制TGF-β1诱导的HSC中α-SMA的表达;正常HSCSmad3主要表达在细胞质中,细胞核中表达较低,TGF-β1可显著刺激Smad3向细胞核转移,扶正化瘀方药物血清可明显抑制TGF-β1诱导的Smad3核转位。结论:扶正化瘀方可下调纤维化大鼠肝脏及HSC中的TGF-β1/Smad病理信号转导通路,这可能是扶正化瘀方抗肝纤维化的部分作用机制。

当归补血汤对大鼠肝纤维化与肝脏脂质过氧化的影响

目的观察当归补血汤对大鼠肝纤维化的作用及其影响肝脏脂质过氧化的抗肝纤维化作用机制。方法Wistar雄性大鼠采用四氯化碳(CCl4)皮下注射及高脂低蛋白饮食复合因素诱导复制大鼠肝纤维化模型。模型大鼠随机分为模型组(14只),当归补血汤组(14只);另设正常组(10只)。自造模之日起,当归补血汤组以6 g/kg的大鼠体重剂量灌胃,每日1次,共6周。正常组与模型组灌胃以等量生理盐水。HE染色观察肝组织炎症与脂肪变性,天狼猩红染色观察肝组织胶原沉积。试剂盒法测定血清肝功能指标,包括丙氨酸转氨酶(ALT)与天冬氨酸转氨酶(AST)水平、总胆红素(TBil)与白蛋白(Alb)含量。生化法测定肝组织甘油三脂(TG)与丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性,Jamall氏法测定肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,Western印迹法分析肝组织Ⅰ型胶原蛋白表达。结果与正常大鼠比较,模型大鼠血清ALT、AST水平及TBil含量明显升高,Alb含量明显降低;肝组织脂肪变性与胶原沉积明显,TG与MDA含量增加,SOD活性降低(均P<0.05)。当归补血汤组大鼠肝组织脂肪变性与胶原病理沉积显著改善;血清ALT、AST水平及TBil含量降低,血清Alb含量升高;肝组织Hyp、TG与MDA含量降低,SOD活性提高(均P<0.05)。结论当归补血汤具有良好的抗实验性大鼠肝纤维化作用,其主要作用机制与抗肝脏脂质过氧化损伤有关。

扶正化瘀方及其治法拆方对肝损伤小鼠肝细胞凋亡的干预作用

目的:观察扶正化瘀方治法拆方对小鼠肝细胞凋亡的影响,并探讨扶正化瘀方影响肝细胞凋亡的治法特点与作用机制。方法:BABL/c雄性小鼠50只,随机分为正常组、模型组、扶正化瘀方组、扶正拆方组和化瘀拆方组,每组各10只。采用脂多糖(10μg/kg)联合半乳糖胺(900mg/kg)腹腔注射诱导急性肝损伤。各用药组小鼠于造模前3d开始分别给予扶正化瘀方、扶正拆方和化瘀拆方灌胃,每日2次,连续3d,第4日灌胃后1h开始造模;正常组与模型组小鼠给予等量生理盐水灌胃。采用比色法检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(super-oxide dimutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;苏木精-伊红染色观察肝组织炎症病理改变;原位末端标记法观察肝组织肝细胞凋亡情况;荧光定量实时聚合酶链式反应法检测肝组织肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA表达;蛋白印迹法检测肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(tumor necrosis factor receptor typeⅠ,TNFR1)蛋白表达。结果:与模型组比较,扶正化瘀方及其拆方药物扶正拆方、化瘀拆方均可显著降低模型小鼠血清ALT和AST活性,改善肝组织炎症,减轻肝细胞凋亡,改善肝组织过氧化指标SOD活性和MDA含量,其中全方作用最好,扶正拆方优于化瘀拆方。与正常组比较,模型组肝组织TNF-αmRNA表达显著升高,扶正化瘀方及扶正拆方、化瘀拆方可显著降低其表达,其中全方作用最好,两拆方组相比差异无统计学意义。与正常组比较,模型组肝组织TNFR1蛋白表达显著升高,全方可显著降低其表达,而两拆方无明显作用。结论:扶正化瘀方和其治法拆方中扶正方可抑制小鼠肝细胞凋亡,扶正化瘀方抗肝细胞凋亡作用机制可能在于减轻肝脏脂质过氧化损伤和下调TNF-α及TNFR1的表达。

当归补血汤及其拆方影响肝脏血管新生的药效特点及作用机制

目的观察当归补血汤及其拆方影响肝脏血管新生的抗肝纤维化的药效特点。方法 48只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、当归补血汤组、黄芪组、当归组及索拉非尼对照组。以四氯化碳(CCl4)与高脂低蛋白饮食复合因素诱导肝纤维化模型。通过病理对肝组织形态学进行观察,试剂盒测定血清肝功能、肝组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS);盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸(Hyp);电镜观察肝窦内皮窗孔结构;同步辐射X线二维成像观察微血管。组间比较使用单因素方差分析,方差齐时用LSD进行两两比较,方差不齐时用Tamhane's T2。结果当归补血汤及其拆方组白蛋白(Alb)显著提高(P<0.05)、AST显著降低(P<0.05);当归补血汤及黄芪组ALT显著降低(P<0.05);各用药组肝组织Hyp含量显著降低。各用药组血管纹理有不同程度的减少;窗孔数量增加。当归补血汤及其拆方组SOD活性显著升高(P<0.05),全方及拆方组NOS显著降低(P<0.05),黄芪组MDA显著降低(P<0.05),全方组及黄芪组NO显著降低(P<0.05)。结论当归补血汤及其拆方具有抗肝纤维化及抗血管新生的作用。其机制可能与保护肝窦内皮细胞损伤、抗脂质过氧化有关,黄芪改善炎症、抗脂质过氧化及NO释放作用较为突出。

中药内服外敷治疗肝硬化难治性腹水的疗效观察

目的:探讨病证结合中药内服与消胀贴膏脐部外敷对肝硬化难治性腹水的治疗作用。方法:选择2011年3月至2014年2月我科肝硬化难治性腹水患者80例,随机分为对照组与观察组,对照组以常规西药治疗,观察组在其基础上,采用病证结合中药复方内服,并脐敷中药消胀贴膏。比较治疗前后患者体重、腹围、24小时尿量、主要症状(腹胀、纳食、排气、排便)及血清肝肾功能、电解质。结果:脱落1例,完成79例。2组患者基线资料一致。对体重、腹围、尿量以及主要症状,2组治疗后均明显改善,而治疗前后体重、腹围、尿量、腹胀、纳食及排气前后差值的组间比较,观察组均优于对照组,观察组显效率明显高于对照组。2组间治疗前后肝肾功能及电解质差值无统计学意义。结论:对于肝硬化难治性腹水患者,病证结合中药内服与消胀贴膏脐部外敷可提高常规西药治疗的临床疗效。

基于胃肠动力调节与透皮吸收探讨中药外用制剂消胀贴膏治疗肝硬化腹水的作用机制

基于"消胀贴膏"敷脐促进肝硬化腹水减退的临床疗效,及该药促进患者排气与减轻腹胀的作用特点,结合胃肠动力影响肝硬化腹水的研究进展,探讨消胀贴膏调节胃肠动力促进肝硬化腹水消退的作用机制及效应物质。首先观察药物敷贴对肝硬化腹水动物胃肠动力、腹内压、肾血流与腹水量的影响及其相关关系;分析药物对模型动物胃肠激素、血管活性因子及胃肠动力调节关键细胞-Cajal间质细胞数量与功能的作用。继之,观察药物对离体胃肠组织平滑肌收缩、对Cajal间质细胞SCF/c-kit信号通路等的影响。最后,分析消胀贴膏的整体动物与离体皮肤透皮入血成分,并评价其影响小肠平滑肌收缩的活性。最终验证"消胀贴膏主要通过促进胃肠动力,从而降低腹内压,增加肾血流量,促进腹水减退,并且具有透皮吸收的效应成分"的科学假说,部分诠释中医"气行则水行"的科学内涵,阐明消胀贴膏外用治疗肝硬化腹水主要作用原理,提高中医药外治法的基础研究水平。