人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析

背景:现有的外泌体蛋白组学研究中,只有不同来源外泌体或者不同条件下分泌的外泌体之间的蛋白组学对比,没有外泌体和其母体细胞之间的对比分析。目的:对人脐带间充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学分析。方法:培养人脐带间充质干细胞并采用超滤序贯超离法提取外泌体,通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质定量、蛋白质印迹法及蛋白组学分析等技术鉴定。结果与结论:(1)提取的外泌体分散度较好且均一,多为杯状圆形或类圆形的膜性小囊泡,可见囊泡的双膜性结构,中央为低电子密度成分,分布较集中且边界清晰;(2)外泌体粒径分布峰值为(129.5±8.7)nm,膜表面带负电荷,浓度为8.375×10^(10)粒子/mL,平均zeta电位为(-28.1±3.6)mV;(3)外泌体有特征性膜蛋白CD9、CD63的表达;(4)蛋白组学分析外泌体中高表达的蛋白质大多参与RNA剪接、mRNA加工、蛋白折叠等生物过程,参与RNA/DNA等遗传物质及蛋白质的合成、加工、降解过程,参与组成多种细胞器及亚细胞膜结构,参与多条信号通路、细胞黏附、细胞外基质受体相互作用,与多种疾病和病毒致癌也密切相关;(5)通过分析认为外泌体与其母体细胞相比有一定的同质性和差异性,差异蛋白功能均和免疫无关,故验证了人脐带间充质干细胞来源外泌体的低免疫原性和安全性。

hsa_circ_0005221通过miR-339-5p/STAT5A通路促进前列腺癌进展

目的:研究hsa_circ_0005221通过miR-339-5p/STAT5A通路调控前列腺癌的进展的分子机制。方法:核质分离检测hsa_circ_0005221和miR-339-5p在细胞中的表达定位;Pulldown检测hsa_circ_0005221结合的miRNA;软件预测结合荧光素酶报告基因确定与hsa_circ_0005221结合的RNA是miR-339-5p;定量PCR检测hsa_circ_0005221在前列腺上皮细胞和前列腺癌细胞的表达量;在前列腺癌细胞分别转染hsa_circ_0005221过表达质粒和siRNA测DU145和LNCaP增殖、侵袭和迁移能力及上皮间质转化(EMT)和凋亡水平;在敲低hsa_circ_0005221基础上,转染miR-339-5P mimics和inhibitor测DU145和LNCaP增殖、侵袭和迁移能力及EMT标志性蛋白、STAT5A和凋亡水平。结果:hsa_circ_0005221在前列腺癌细胞的表达水平明显高于前列腺上皮细胞。核质分离实验表明hsa_circ_0005221、miR-339-5P均主要在胞质中表达。在DU145和LNCaP敲低hsa_circ_0005221,其增殖、侵袭、迁移及EMT能力明显下降;凋亡水平增加。过表达hsa_circ_0005221则结果相反。在软件预测排名前5的miRNA中,Pulldown实验结果显示与hsa_circ_0005221结合的有miR-339-5P、miR-17、miR-520H;敲低或过表达hsa_circ_0005221,miR-339-5P变化最明显。荧光素酶报告基因结果显示hsa_circ_0005221与miR-339-5P结合。在DU145和LNCaP敲低hsa_circ_0005221基础上转染miR-339-5P mimics,其增殖、侵袭和迁移能力明显下降,凋亡水平增加,E-cad水平增加,N-cad水平下降,STAT5A表达水平增加。敲低hsa_circ_0005221基础上上转染miR-339-5P mimics则结果相反。结论:hsa_circ_0005221通过miR-339-5p/STAT5A通路促进前列腺癌的进展。