LncRNA UNC5B-AS1对肺癌细胞黏附、侵袭及迁移的影响及其机制

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA) UNC5B-AS1调控miR-218-5p的表达影响肺癌细胞黏附、侵袭和迁移及其作用机制。方法:选取2017年6月至2019年6月在重庆三峡中心医院肿瘤科经手术切除的20例肺癌患者癌组织和对应癌旁组织标本,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肺癌组织和癌旁组织及其支气管上皮细胞HBE和不同肺癌细胞A549、H1437、H1975、H1299和H460中UNC5B-AS1的表达。将UNC5B-AS1 siRNA转染至肺癌A549细胞,采用黏附实验、Transwell侵袭实验及划痕实验检测下调UNC5B-AS1对A549细胞黏附、侵袭和迁移能力的影响;qRT-PCR和双荧光素酶报告基因检测实验鉴定UNC5B-AS1对miR-218-5p的靶向调控关系;Western blot检测上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达情况。结果:肺癌组织和细胞中UNC5B-AS1表达显著高于癌旁组织和支气管上皮细胞(P<0.05),UNC5B-AS1在肺癌A549细胞中的表达量最高(P<0.05)。下调UNC5B-AS1的表达能够抑制A549细胞黏附、侵袭和迁移能力(P<0.05)。qRT-PCR和双荧光素酶报告基因检测结果表明UNC5B-AS1能靶向调控miR-218-5p的表达。下调UNC5B-AS1可抑制E-cadherin蛋白表达,促进Vimentin和Twist蛋白表达。结论:lncRNA UNC5B-AS1通过靶向调控miR-218-5p的表达促进肺癌细胞黏附、侵袭和迁移,其作用机制可能与促进EMT的发生有关。

mir-151a-5p对肺癌A549细胞生物学功能和化疗敏感性的影响

目的通过下调mir-151a-5p在肺癌A549细胞中的表达,研究其对细胞增殖、迁移、侵袭能力和化疗敏感性的影响。方法应用RT-qPCR检测mir-151a-5P在肺腺癌组织和肺腺癌细胞株以及转染inhibitor后的表达情况。通过CCK-8、Transwell、克隆形成实验分别检测转染inhibitor后A549细胞的增殖、迁移、侵袭能力以及克隆形成能力的变化。Western blot检测转染后EMT相关蛋白的表达。CCK-8、流式细胞术检测转染后A549细胞对顺铂的敏感性变化。结果 mir-151a-5p在人肺腺癌组织中的表达较正常肺组织明显升高(P<0.01),且在4种肺癌细胞株(H1975、H1299、H2228、A549)中,A549细胞中mir-151a-5p表达量较高(P<0.01)。成功构建了mir-151a-5p-inhibitor转染的A549细胞(P<0.01)。mir-151a-5p inhibitor转染组较NC对照组细胞的增殖能力、迁移侵袭能力以及克隆形成能力都明显降低(P<0.05)。Western blot检测结果显示,与NC对照组比较,mir-151a-5p inhibitor转染组E-cadherin表达明显升高,而N-cadherin、Vimentin、Notch1表达明显下降(P<0.01)。CCK-8结果显示mir-151a-5p inhibitor转染组IC_(50)显著低于NC对照组(P<0.01)。流式细胞术检测结果显示,加入顺铂后mir-151a-5p inhibitor转染组凋亡率显著高于NC对照组(P<0.01)。结论下调mir-151a-5p能显著抑制A549细胞的增殖、迁移及侵袭能力,并能够增加对顺铂的化疗敏感性。

缺氧微环境下晚期糖基化终末产物对结肠癌HCT116细胞侵袭、迁移的影响

目的研究在缺氧微环境下,晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)对结肠癌HCT116细胞的增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法用CCK-8法筛选出促进HCT116细胞增殖的最佳AGEs浓度(200μg/mL),最佳作用时间为48 h。然后将HCT116细胞分为空白对照组、AGEs(200μg/mL)组、缺氧组、缺氧+AGEs(200μg/mL)组。用流式细胞术检测细胞周期,用Transwell侵袭及迁移实验检测HCT116细胞体外侵袭及迁移能力。最后用Western blot方法检测HIF-1α、RAGE,EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin以及侵袭相关蛋白MMP2的表达水平。结果与空白对照组相比,缺氧微环境可促进HCT116细胞的增殖,但AGEs对HCT116细胞增殖的影响较小。体外侵袭迁移实验结果显示:与空白对照组相比,其余3组中细胞的侵袭及迁移能力逐渐增强。Western blot结果显示:HIF-1α在常氧环境下表达水平较低,在缺氧状态下表达水平显著升高;与此同时,在缺氧状态下,加入AGEs后,HIF-1α表达进一步升高。在常氧和缺氧环境中,AGEs均能增加RAGE的表达量,但缺氧环境下更明显。与空白对照组相比,其余3组中MMP2、N-cadherin、Vimentin表达逐渐升高,E-cadherin表达逐渐降低。结论在缺氧环境下AGEs能够进一步增强HCT116细胞的侵袭、迁移能力,但对HCT116细胞增殖的影响较小。

HIF1α特异性人源喉癌噬菌体单链抗体的制备及其对放疗增敏的实验研究

目的利用噬菌体肽库技术,构建HIF1α人源喉癌单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),研究其对放疗敏感性的影响。方法提取喉癌患者癌旁阳性淋巴结总RNA,通过RTPCR和重叠延伸PCR扩增得到可变区基因scFv,将其重组到载体pCANTAB5E中,转化至TG1大肠杆菌,以制备初级抗体库。以HEP2细胞及HIF1α纯化抗原对抗体库进行淘选。SDS-PAGE电泳检测scFv的可溶性表达,Western blot检测其对HIF1α蛋白表达的影响,ELISA和细胞免疫化学鉴定其特异性,CCK-8检测scFv联合X线照射后HEP2细胞的存活率,克隆形成实验分析scFv处理后HEP2细胞放疗存活曲线。结果成功制备HIF1α人源喉癌单链抗体scFv,SDS-PAGE电泳证实其可溶性表达且相对分子质量约为34×10~3,Western blot表明其能下调HIF1α蛋白的表达。ELISA检测到该抗体对HIF1α抗原的识别率高达79%,细胞免疫化学显示该抗体与HEP2细胞特异性结合。CCK-8检测结果显示scFv联合X线照射后,较单纯X线照射组明显降低了HEP2细胞的存活率(P<0.05),克隆形成实验结果显示scFv对放射的增敏比为1.89。结论成功构建了HIF1α人源喉癌单链抗体,且其能增加HEP2细胞对放疗的敏感性。

乏氧条件下坎地沙坦增加肺腺癌A549细胞放射敏感性

目的:探讨乏氧条件下坎地沙坦对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响及其机制。方法:将A549细胞分为常氧组、乏氧组和坎地沙坦+乏氧组,ELISA检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的表达,Western blot检测乏氧诱导因子1α(HIF-1α)、P53和P21的表达,流式细胞术检测细胞周期分布,CCK-8检测细胞增殖,克隆形成实验检测经X线照射后的细胞存活分数。结果:与常氧组相比,乏氧组AngⅡ表达显著上调(P<0.01),HIF-1α、P53和P21表达均上调,细胞周期G0/G1/S比例显著增加(P<0.05),细胞增殖无显著差异(P>0.05),但细胞存活分数显著增加(P<0.01)。用坎地沙坦处理乏氧A549细胞后,与乏氧组相比,坎地沙坦+乏氧组AngⅡ表达无显著差异(P>0.05),但HIF-1α、P53和P21表达均下调,细胞周期G0/G1/S比例显著降低(P<0.05),细胞增殖无显著差异(P>0.05),但细胞存活分数显著降低(P<0.01)。结论:坎地沙坦能增加乏氧条件下肺腺癌A549细胞放射敏感性,相关机制可能为坎地沙坦下调HIF-1α表达后抑制细胞周期G0/G1/S阻滞。

薏苡仁酯对同源不同辐射抗性鼻咽癌细胞增殖及凋亡的作用

探讨薏苡仁酯（coixenolide,CXL）对同源不同辐射抗性鼻咽癌细胞增殖及凋亡的影响,探讨其可能的作用机制。采用CCK-8法、DAPI染色法及流式细胞术检测CXL作用后CNE-2R和CNE-2细胞活性及凋亡的情况,Western blotting法检测凋亡相关基因的蛋白表达水平。CCK-8法显示CXL呈剂量-时间依赖性的抑制CNE-2R（24 h,48 h,72 h的IC_（50）分别为273.20 g/L,10.88 g/L和4.55 g/L）和CNE-2（24 h,48 h,72 h的IC_（50）分别为256.60 g/L,5.44 g/L和2.43 g/L）的细胞活性;DAPI染色显示CXL组细胞中观察到染色质浓缩、边集和分割成块状;与对照组相比,流式细胞术显示CXL作用于CNE-2R（（4.51依0.09）vs（11.68±3.54）,p〈0.05）和CNE-2（（5.27±0.14）vs（15.68±2.76）,p〈0.05）细胞凋亡率均明显增加;Western blotting法显示,CXL组Bax、Caspase-9、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP蛋白表达量较对照组均显著增加（p〈0.05）,Bcl-2蛋白表达量显著降低（p〈0.05）,Bcl-2/Bax比值降低（p〈0.001）。上述均表明CXL可抑制同源不同辐射抗性鼻咽癌细胞的增殖及诱导其凋亡,其作用机制可能与凋亡调节基因的表达变化有关。