基于生物信息学分析miR-629-3p在头颈部肿瘤发生中的作用

目的探讨微小RNA(miRNA-629-3p)在头颈部鳞状细胞癌中的表达及其相关临床意义。方法通过TCGA数据库数据进行生物信息学方法分析,获得在头颈部肿瘤中表达的微小RNA,选取高表达的miR-629-3p;K-M plot观察miR-629-3p对患者生存的影响;TIMER2.0分析与免疫浸润的相关性;Western blot法检测相关蛋白的表达采用水平。结果miRNA-629-3p在头颈部肿瘤患者中高表达;miR-629-3p作为预测生存预后的一个指标具有较高的敏感度和特异度;免疫浸润分析得出,T、B及NK细胞参与了头颈部肿瘤的浸润,且与miR-629-3p的表达具有明显的相关性;沉默miRNA-629-3p后,Wnt、β-catenin和Survivin的表达水平明显降低,而E-cadherin的表达水平明显升高。结论头颈部肿瘤患者的miRNA-629-3p表达水平上调,可能在恶性转化过程中起到重要作用,有望成为评估头颈部肿瘤患者病情的有效指标。

CIK细胞的制作及对不同肿瘤细胞株体外抗肿瘤作用的研究

目的:制备细胞因子激活杀伤(CIK)细胞并观察其生物学特性及对不同肿瘤细胞株的杀伤作用。方法:外周血单个核细胞用无血清培养基经干扰素γ(IFNγ),CD3McAb,白介素2(IL2),白介素1α(IL1α)诱导,制作CIK细胞,以淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)作为对照,流式细胞仪检测CIK细胞的免疫表型,MTT法检测其对不同肿瘤细胞株的杀瘤活性。结果:CIK细胞与LAK细胞相比增殖速度快、最终增殖倍数高。CIK细胞主要由CD3和CD56双阳性细胞构成。CIK细胞对多种肿瘤细胞具有较强的杀伤活性。结论:CIK细胞过继免疫治疗是一种非常有前景的抗肿瘤治疗方法。

miR26a靶向EZH2抑制肝癌HepG2细胞的增殖活性

目的探讨mi R26a靶向EZH2抑制肝癌Hep G2细胞的增殖活性的影响并探讨其可能的分子机制。方法设计合成mi R26a mimic,将细胞分为转染试剂对照组(mock)、阴性对照组(control)和mi R26a mimic组,采用Real-time PCR检测转染后细胞中mi R26a的表达水平,MTT检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞的凋亡情况,双荧光素酶报告基因系统检测mi R26a与EZH2的靶向关系,Western blot检测各组细胞中EZH2蛋白的表达。结果 MTT分析及流式细胞术的检测证实过表达mi R26a能够抑制肝癌细胞的增殖效应,促进肝癌细胞的凋亡,双荧光素酶报告基因系统以及Western blot的结果均证实mi R26a能够显著下调EZH2在蛋白水平的表达。结论 mi R26a能够显著抑制肝癌Hep G2细胞的增殖活性,并且与EZH2之间存在良好的靶向关系。

Alzheimer病动物模型的构建及其分子病理学的变化

目的建立能够在行为、生物化学以及组织病理方面较好地模拟AD的动物模型。方法采用MR I,γ-刀立体定位射频热凝损毁老年猴脑的穹隆-海马伞建立动物模型;应用Hedreen方法、免疫组织化学ABC法检测AD动物模型的分子病理学的变化。结果损伤侧海马CA1区的AchE阳性纤维密度明显低于对侧未损伤的对应区的纤维密度;动物模型大脑皮质的大锥体神经元胞体中均可见APPA4的免疫活性物质、抗Tau免疫活性物质沉着,形态上有的近似人AD的老年斑;大脑损伤侧内侧隔核的ChAT阳性神经元的数目明显少于对侧。结论所建立的AD动物模型在理论和实验中接近于AD的病理改变。

MicroRNA-100调节mTOR表达对肝癌细胞侵袭转移及上皮间质转化的影响及机制研究

目的:探讨microRNA-100调节m TOR表达对肝癌细胞侵袭转移及上皮间质转化的影响并研究其可能的分子机制。方法:通过脂质体介导将microRNA-100模拟物及阴性对照转染Hep G2细胞,将细胞分为转染试剂对照组(mock)、阴性对照组(control)和microRNA-100 mimic(miRNA-100 mimic)组。采用realtime PCR检测转染后细胞中miRNA-100的表达水平,Western blot检测m TOR的表达变化,细胞划痕实验检测细胞的迁移能力,Tranwell检测细胞的侵袭能力,Western blot检测细胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、α-SMA和E-cadherin的表达。结果:过表达miRNA-100通过抑制m TOR的表达抑制肝癌细胞的迁移及侵袭能力,并通过下调肝癌细胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin和α-SMA的表达,上调E-cadherin的表达,阻抑上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程的发生。结论:MicroRNA-100可能通过降低m TOR的表达抑制肝癌细胞的转移侵袭能力,并抑制上皮间质转化过程的发生。

CIK细胞联合表柔比星对肝癌的体内外杀伤作用研究

目的研究CIK细胞联合表柔比星对肝癌细胞BEL-7402的体内外杀伤效应。方法取健康人外周血单个核细胞,经IFN-γ、IL-1、IL-2、抗CD3单抗诱导CIK细胞成熟,流式细胞仪检测培养第1、7、14d的CIK细胞表型。CellCountingKit-8试剂盒(CCK-8)检测CIK细胞、表柔比星及两者联合对肝癌细胞BEL-7402的体外杀伤效应。用肝癌细胞BEL-7402建立裸鼠皮下移植瘤模型,分为生理盐水对照组、CIK治疗组、表柔比星组、CIK联合表柔比星治疗组(联合组),观察它们对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结果CIK细胞经多种细胞因子诱导培养后,CD3+CD56+细胞比例明显上升,14d时CD3+CD56+细胞比例达(46.83±2.53)%,与第1天比差异有显著性(P<0.01),细胞量扩增了近1000倍。联合组对肝癌细胞的杀伤率明显高于各单独治疗组,差异有显著性(P<0.05)。体内实验表明,CIK细胞联合表柔比星可明显抑制裸鼠肝癌细胞种植瘤的生长且无明显副作用。结论细胞因子活化杀伤细胞疗法联合化疗能显著抑制体内外肝癌细胞BEL-7402的生长,为肝癌的生物化疗提供了实验室依据。

Alzheimer微管相关蛋白tau在猴脑中的分布及意义

目的研究Alzheimer微管相关蛋白tau在老年猴脑中的分布,探讨老年猴是否能作为Alzheimer氏病(AD)神经原纤维缠结(NFT)病变动物。方法应用免疫组织化学法检查老年猴脑组织广泛部位中tau蛋白沉积,并与传统的神经病理技术GleeMarsland氏法银染色对比。应用免疫印迹法(Westernblot)检查老年猴脑组织内tau蛋白与人类脑组织内tau蛋白的免疫活性蛋白电泳带的分子量范围的一致性。结果老年猴脑海马、扣带回、颞叶及额叶脑皮质的锥体神经元的胞体、轴突及星形细胞的胞浆可见条状、块状或卷发状,缠结样免疫活性物质沉着。tau蛋白的免疫组织化学染色方法较GleeMarsland法银染色敏感而可靠。老年猴脑组织内tau蛋白与人类脑组织的tau蛋白免疫活性蛋白电泳带的分子量范围具有一致性。结论老年猴脑中有类似人AD的NFT病变。老年猴可直接作为AD研究的动物模型的可能性。

PSMA/4-1BBL共转染DC疫苗联合CIK细胞体外抑制前列腺癌的实验研究

目的:本研究通过复制缺陷性腺病毒介导的人前列腺特异性膜抗原基因(PSMA)和肿瘤坏死因子配体超家族成员(4-1BBL)体外共同转染树突状细胞(DC)后,与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,观察其体外抑制前列腺癌的生物学效应。方法:将Ad-PSMA、Ad-4-1BBL、Ad-GFP按MOI=200∶1转染DC作为刺激细胞,分为共转染组、PSMA转染组、4-1BBL转染组、阴性对照组(Ad-GFP-DC组)以及未转染DC组,Western blot法检测各组DC细胞中PSMA和4-1BBL蛋白的表达;流式细胞仪分析CD80、CD83、CD86等表型变化;取患者外周静脉血单个核细胞中淋巴细胞用于CIK细胞的诱导培养,按DC∶CIK=1∶10比例将上述不同转染组DC加入CIK中,共同孵育96h(设普通DC刺激组和单独CIK细胞组为对照),收获的细胞作为效应细胞,流式细胞仪测定不同DC刺激组CIK细胞CD3、CD56表达率,ELISA法检测不同DC-CIK组培养上清IFN-γ、IL-10水平;PE-7AAD凋亡试剂盒检测不同DC-CIK组对人前列腺癌细胞株LNCap、Du145的细胞毒作用。结果:Western blot结果证实PSMA、4-1BBL可在DC上成功表达;各转染组DC表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR共刺激分子表达上调,与未转染组相比较差异显著(P<0.05)。培养14d,不同DC疫苗刺激组CIK以及单独CIK细胞组中CD3+、CD56+、CD3+/CD56+T细胞比例均高于培养7d的CIK,差异显著(P<0.05),其中经不同DC疫苗刺激的CIK组上升较单独培养14d-CIK组更明显(P<0.05)。DC-CIK培养上清中PSMA/4-1BBL-DC-CIK组IFN-γ分泌量最高,达1176.10±14.37pg/5×106cells,IL-10分泌量最低,为75.14±2.01 pg/5×106cells,与其他各组比较,差异显著(P<0.05)。不同组别DCCIK作用于LNCap、Du145细胞24h后,荧光显微镜下观察细胞凋亡和坏死明显。同一组别DC疫苗刺激下的CIK细胞对LNCap的杀伤作用强于DU145细胞,差异显著(P<0.05)。而在针对同一种肿瘤细胞时,PSMA/4-1BBL-DC-CIK组的杀伤作用最强,LNCap细胞的凋亡率可达(24.56±1.68)%,Du145细胞凋亡率可达(12.67±0.94)%,与PSMA-DC-CIK组、4-1BBL-DC-CIK组相比,差异显著(P<0.05),而PSMA-DC-CIK和4-1BBL-DC-CIK组的前列腺癌细胞的凋亡率则无显著差异(P>0.05),但与GFP-DC-CIK、普通DC-CIK、和单独CIK组相比差异显著(P<0.05)。结论:本实验中Ad-PSMA/4-1BBL高效转染的DC具有成熟DC的典型特征,与CIK共培养后提高了CD3+/CD56+T细胞比例,IFN-γ分泌量显著增高,并增加了对PSMA阳性靶细胞的特异性杀伤,比普通DC-CIK及单独CIK具有更强的杀伤活性。两种肿瘤相关抗原转染DC与CIK共培养后可以更有效地提高CIK细胞的杀伤活性。

HSV-1载体中介lacZ基因导入大鼠中枢神经系统及其表达的研究

目的研究用HSV-1载体将外源基因导入大鼠中枢神经系统的方法。方法将HSV-1载体接种于大鼠嗅神经末梢,在不同时间取各部位脑组织检测lacZ基因表达产物β-半乳糖苷酶活性,并观察大鼠脑组织局部及全身的病理学和免疫学变化。结果接种HSV-l载体后2d在嗅球中检测到β-半乳糖苷酶活性,接种后4d在嗅球、嗅前神经核、蓝斑、杏仁核、海马、颞叶皮质、间脑以及最后区均检测到β-半乳糖苷酶活性,并持续10周以上;脑组织及全身各脏器未见病理学及免疫学改变。结论HSV-1载体可通过大鼠嗅神经通路将外源基因导入中枢神经系统并在其中表达。

猴脑中Alzheimer前体蛋白A_4的分布及意义

目的研究老年猴脑中Alzheimer前体蛋白A4(AppA4)的分布,探讨老年猴作为Alzheimer病(AD)淀粉样蛋白沉积动物模型的可能性。方法应用免疫组织化学法检查老年猴脑组织广泛部位中AppA4的沉积,并且与传统的神经病理技术刚果红染色相对比。应用免疫印迹法(Western印迹法)检查其脑组织内AppA4与人类脑组织内AppA4的免疫活性蛋白电泳带的分子量范围的一致性。结果老年猴脑海马、扣带回、颞叶及额叶脑皮质的锥体神经元的胞体、轴丘及近端树突AppA4免疫活性物质沉着,上述部位脑皮质细胞外可见斑块样沉积,部分皮质小动脉壁可见AppA4免疫活性物质沉积。AppA4免疫组织化学染色方法较淀粉样蛋白组化方法敏感而可靠。老年猴脑组织内AppA4与人类脑组织的AppA4免疫活性蛋白电泳带的分子量范围具有一致性。结论老年猴脑中有类似人AD的淀粉样蛋白沉积病变,有作为淀粉样蛋白沉积动物模型的可能性。

HSV-1载体对体外培养神经元感染作用的研究

目的利用重组有lacZ基因的HSV-1假型病毒载体感染体外培养的人胚神经元,(以β-gal组织化学染色来检测报告基因lacZ在神经元中的表达),并观察该载体的细胞毒性及病毒的水平传播情况。方法用重组有lacZ基因的HSV-1扩增子质粒pHSVlac包装成复制缺陷的假型病毒载体,并在Vero细胞中传代增殖,产生高滴度的病毒载体,用其感染体外原代培养的神经元,以β-gal染色观察报告基因lacZ在神经元中的表达及该载体的细胞毒性。结果pHSVlac质粒与HSV-1 17 ts K可在Vero细胞中包装成复制缺陷的HSV-1假型病毒载体,经传代其滴度可达1×108PFU/mL。该载体在37℃时能感染体外原代培养的人胚神经元,并在其中表达LacZ基因,未发现细胞毒性改变。结论HSV-1载体能够高效靶向地将外源基因导入非分裂的神经元,HSV-1载体介导的基因转移系统的建立为进一步开展神经机能及神经系统疾病的基因治疗的研究奠定了基础。

蟾蜍灵对人食管鳞癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响

目的观察蟾蜍灵对人食管鳞癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响,探讨其对人端粒酶逆转录酶(hTERT)核-线粒体定位的影响。方法采用不同浓度蟾蜍灵作用EC9706细胞,CCK-8法测定细胞增殖抑制并计算半数抑制浓度(IC50),PI染色流式细胞仪分析细胞周期,Hoechst 33342染色荧光显微镜观察凋亡核形态改变,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot法及多重免疫荧光标记激光共聚焦显微镜检测hTERT亚细胞定位及蛋白表达。结果随作用时间及浓度的增加,蟾蜍灵可显著抑制人食管鳞癌EC9706细胞的增殖(P均<0.01)。100 nmol/L蟾蜍灵作用EC9706细胞时,随着作用时间的延长,G1期细胞逐渐减少,S及G2/M期细胞显著增加(P均<0.05);细胞核发生典型的凋亡形态学改变,凋亡率逐渐增加(P<0.01)。hTERT可表达于EC9706细胞线粒体中,在蟾蜍灵诱导的凋亡过程中,细胞核hTERT的表达减少,而线粒体hTERT的表达则有所增加(P<0.05)。结论蟾蜍灵可抑制EC9706细胞增殖,诱导其凋亡,细胞周期阻滞于S及G2/M期。hTERT除细胞核外还定位于线粒体中,并在蟾蜍灵诱导的凋亡过程中由细胞核向线粒体转位。

体外培养的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞相互作用的研究

目的观察同源的树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞于体外同一培养体系共同培养时的相互影响,为临床联合应用DC和CIK细胞进行肿瘤生物治疗提供依据。方法用无血清培养基进行DC和CIK细胞的体外培养制作,共同培养1w后,检测CIK细胞免疫表型、杀瘤活性的变化以及DC分泌IL-12的变化。结果DC与CIK细胞的共培养会增加CIK细胞的CD3CD56双阳性细胞的比例和非特异性增强对K562细胞的杀伤活性;同时增强DC分泌IL-12的能力。结论体外共培养DC与CIK细胞可相互增强抗肿瘤免疫活性。

正常人和肿瘤患者CIK细胞的体外增殖能力及抗肿瘤作用的对比分析

目的:探讨正常人和肿瘤患者CIK细胞体外增殖能力及抗肿瘤作用的差异。方法:分离正常人和肿瘤患者的外周血单个核细胞(PBMC),加入细胞因子(CK),体外诱导CIK细胞,用细胞计数板法观察CIK细胞增殖能力及随时间变化的趋势,用MTT法检测其对不同肿瘤细胞株的杀伤活性。结果:与正常人CIK细胞相比,肿瘤患者CIK细胞的增殖速度较慢,其最大增殖倍数低(P<0.01);CIK细胞的增殖速度与年龄有关,即低年龄段的CIK细胞增殖能力强;正常人的CIK细胞对乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)、肺巨细胞癌细胞株(BE-1)和前列腺癌细胞株(PC-3)的杀伤活性明显高于肿瘤患者的CIK细胞(P<0.01);不同年龄段肿瘤患者的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤率差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CIK细胞的体外增殖力及对肿瘤细胞的杀伤活性与年龄有关,正常人CIK细胞的体外增殖力及对肿瘤细胞的杀伤活性高于肿瘤患者的CIK细胞。

DC-CIK共培养细胞联合索拉菲尼对肝癌细胞体内外的杀伤效应

目的:观察DC、CIK共培养细胞(DC-CIK)联合索拉菲尼(sorafenib)对肝癌细胞BEL-7402的体内外杀伤效应。方法:取健康人外周血单个核细胞,加入不同细胞因子促进DC及CIK细胞成熟并混合共培养。CCK8试剂盒检测DC-CIK共培养细胞联合索拉菲尼对BEL-7402细胞的体外杀伤效应,Annexin V-FITC试剂盒检测两者联合对肝癌细胞凋亡率的影响。用肝癌细胞BEL-7402建立裸鼠皮下移植瘤模型,分为生理盐水对照组、索拉菲尼组、DC-CIK组、DC-CIK+索拉菲尼组,观察它们对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结果:联合组对肝癌细胞的杀伤率及诱导凋亡率均明显高于各单独治疗组,联合组杀伤率高达(75.24±1.91)%,是DC-CIK组的1.8倍,是索拉菲尼单药组的2.1倍(P<0.01);联合组诱导肝癌细胞凋亡率达(78.32±2.54)%,与单独治疗组相比差异有统计学意义(P<0.05)。体内实验表明,DC-CIK+索拉菲尼组可明显抑制裸鼠BEL-7402移植瘤的生长,抑制率为(83.37±0.16)%,与单独治疗组相比差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论:DC-CIK共培养细胞联合索拉菲尼在体内、外可显著抑制肝癌细胞的生长,分子靶向治疗联合细胞免疫治疗可能成为肝癌综合治疗的方法之一。

细胞周期调控因子p27、Cyclin D1和DNA含量在食管癌中联合检测的意义

目的探讨食管癌中CyclinD1、p27的表达及与DNA含量联合测定的意义及相互关系。方法收集食管癌组织及癌周正常组织标本,应用免疫组织化学检测CyclinD1、p27蛋白表达,应用流式细胞术检测DNA含量。结果食管癌组织中CyclinD1和p27蛋白表达阳性率分别为45.8%和33.3%,CyclinD1表达阳性组的DNA含量显著高于CyclinD1表达阴性组分别为(1.54±0.21)和(1.08±0.43),(P<0.05),而p27表达阳性组的DNA含量和SPF值低于p27蛋白表达阴性组分别为(1.10±0.19),(5.56±5.18)%和(1.66±0.28),(19.78±6.12)%,(P<0.05)。结论CyclinD1、p27蛋白与食管癌的发生、发展有关,检测CyclinD1、p27及DNA含量可作为诊断和评估食管癌恶性程度的重要指标.

双抗体夹心ELISA定量检测血清Cap43蛋白方法的建立与评价

目的建立定量检测血清Cap43蛋白表达双抗体夹心ELISA法,并初步探讨血清Cap43蛋白表达水平在肺癌患者与正常人群间有无差异,以及该蛋白表达水平的高低与肺癌组织学分型间的关系。方法建立双抗体夹心ELISA方法对肺癌患者与正常人群血清中Cap43蛋白的含量进行定量检测。结果双抗夹心ELISA包被Ⅰ抗羊抗人NDRG1多克隆抗体(PcAb)、Ⅰ抗兔抗人Cap43PcAb以及辣根酶(HRP)标记的羊抗兔Ⅱ抗的最佳工作浓度分别为1∶750,1∶1200,1∶350,标准蛋白曲线的回归方程为:y=0.53566+0.00046x,R2=0.9939,P<0.0001。应用该方法初步检测结果显示:肺癌组血清标本Cap43蛋白含量明显高于正常对照组(P<0.01),且肺腺癌组病人血清Cap43含量高于肺鳞癌组(P<0.01)。该方法的敏感度(SE)为84.51%,特异度(SP)为35.00%。结论建立了一种敏感度高,重复性好的定量检测血清中Cap43蛋白的双抗体夹心ELISA方法;Cap43蛋白在肺癌患者血清中呈现高表达,且在肺腺癌组病人血清中表达水平高于肺鳞癌组。

兔抗Cap43多克隆抗体制备和初步纯化

目的制备兔抗Cap43多克隆抗体。方法以30个氨基酸组成的多肽为半抗原与钥孔血蓝蛋白(mcKLH)通过碳化二亚胺(EDC)法化学偶联成完全抗原(多肽-mcKLH)免疫家兔;制备兔抗Cap4443多克隆抗体;斑点ELISA法检测抗体效价,经辛酸-硫酸铵法初步纯化抗体后,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳考马斯亮蓝检测其纯化后的纯度。结果经免疫11周得到兔抗Cap43多克隆体,抗体效价为1:500。结论采用EDC化学偶联半抗原和大分子载体蛋白mcKLH,使其成为同时具有免疫原性与免疫反应性的完全抗原,用其免疫家兔获得多克隆抗体。

2004-2015年中国狂犬病发病数据ARIMA乘积季节模型的建立及预测

目的了解我国大陆地区2004-2015年狂犬病的发病情况,建立狂犬病发病的时间序列模型,利用模型进行短期预测,为狂犬病的预防和控制提供参考。方法通过查阅2004-2015年每月的《中华人民共和国卫生和计划生育委员会公报》,获得狂犬病发病的月统计数据,利用2004-2014年的数据建立ARIMA乘积季节模型,并利用建立的模型预测2015年数据,与实际发病数据比较。结果中国2004-2015年总计报告狂犬病25561例,年平均发病率为0.1592/10万,总计报告死亡病例22196例,年平均死亡率为0.1383/10万,2004年-2007年,狂犬病的发病人数和死亡人数逐年上升,2008年至2015年,持续下降。狂犬病具有一定的季节趋势,其中夏秋季节报告发病人数较多,而冬春季节发病人数较少。根据2004-2014年发病资料建立的最优时间序列模型为ARIMA(0,1,1)(0,1,1)12,模型预测2015年发病人数为764,相对误差7.73%。结论我国大陆地区狂犬病发病在2007年达到峰值之后,之后年发病率持续降低。ARIMA乘积季节模型能很好地拟合狂犬病发病的长期趋势和季节趋势,回代拟合和短期预测效果较理想。

人肾癌组织中热休克蛋白70的纯化与鉴定分析

目的探讨人肾癌组织中热休克蛋白70纯化的有效方法,并进行鉴定分析。方法应用两次亲和层析和离子交换层析获得目的蛋白,经电泳和Western-blot定性分析,应用改良的Bradford法定量分析。结果经过二次亲和层析和MonoQ柱的分离后,得到纯度较高的分子量约为70kDa的蛋白质,经免疫印迹分析证实该蛋白质即为HSP70。与其他方法相比HSP70的纯度更高,获得率接近。结论该文所述方法是一种简单有效的纯化肿瘤组织中HSP70的方法。