HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的:克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法:PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果:构建了HIV-1 Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni-NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论:在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1 Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1 Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。

人免疫缺陷病毒Ⅰ型Vif蛋白的原核表达、纯化及单克隆抗体制备

目的:克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)Vif蛋白,制备其单克隆抗体。方法:提取感染了HIV的细胞基因组DNA,PCR扩增vif基因,插入表达载体pET32a,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,Western印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化目的蛋白;免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体。结果:构建了Vif蛋白的原核表达载体vif-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以包涵体形式存在;纯化获得高纯度的重组Vif蛋白,蛋白浓度可达0.56mg/mL;建立了抗Vif蛋白单克隆抗体细胞株,制备了腹水,滴度可达1∶16×106,抗体纯化后保持了活性和特异性。结论:在原核表达系统中表达、纯化了重组Vif蛋白,制备了针对Vif蛋白的单克隆抗体,为研究Vif蛋白的功能和抗原性奠定了基础。

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的:原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法:提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用WesternBlot分析鉴定目的蛋白。结果:构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1.2mg/mL;WesternBlot显示获得了目的蛋白。结论:在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。

我国部分地区HIV感染者HCV协同感染状况的调查研究

目的了解我国部分地区艾滋病病毒(HIV)感染者体内丙型肝炎病毒(HCV)的协同感染状况。方法以我国北京、河南、广西部分地区的HIV感染者为研究对象,通过访谈了解病人的基本状况,采集病人的EDTA抗凝静脉血,对感染者的HIV感染状况、CD4细胞数、HIV病毒载量及HCV感染状况进行检测,分析我国部分地区HIV感染者中HCV的协同感染状况。结果共收集到HIV感染者血液249份,其中有34.14%的感染者同时感染HCV。统计学分析显示,河南地区的HIV感染者同时感染HCV的比例显著高于北京和广西地区;经静脉吸毒和输血传播感染HIV的病人同时感染HCV的几率相近,但都明显高于性传播;感染了HCV的HIV感染者体内的病毒载量要显著高于未感染HCV的HIV感染者,但CD4细胞数没有显著差别。结论HCV协同感染率在不同的HIV感染者人群中存在差异,而且这种协同感染会影响感染者HIV病毒载量,因此在观察HIV感染者疾病进程及考虑治疗措施时,应充分考虑HCV协同感染的影响。

肾病综合征与术后胃瘫综合征患者ALB及胆红素的对比分析

目的低蛋白血症是肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)患者的典型特征之一,其原因可能与大量蛋白随尿液丢失有关。而低胆红素血症亦为NS患者常见临床症状。为揭示二者间的关系,该研究对NS、慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis,CGN)及术后胃瘫综合征(postoperative gastroparesis syndrome,PGS),白蛋白(albumin,ALB)<35 g/L患者的胆红素、ALB及24 h尿蛋白定量进行了对比研究。方法选取NS 187例、原发性CGN 70例、PGS(ALB<35 g/L)64例,检测ALB、尿蛋白(urinary protein,UPR)、尿微量白蛋白/肌酐(urinary microalbuminuria/creatinine,Umalb/cr)及总胆红素(TBIL),应用SPSS 17.0软件分析组间差异及TBIL与UPR、ALB的相关性。结果NS组、CGN组及PGS组人群TBIL、ALB、UPR及Umalb/Cr水平存在显著差异(one-way ANOVA test,P<0.05),且NS组和CGN组TBIL与ALB均呈正相关,TBIL与UPR及Umalb/Cr均呈负相关(Spearman's rho test,P<0.05);但PGS组上述观察指标间未见相关性(Spearman's rho test,P>0.05)。结论 NS患者血胆红素低水平与血ALB水平呈正相关,与尿蛋白、微量ALB水平呈负相关;且PGS及CGN患者对照比较,PGN患者血胆红素与血ALB没有关联性。结果表明,NS患者低血胆红素的原因可能为部分胆红素随尿蛋白的排出而丢失所致。

我国云南部分HIV-1感染者黏合素蛋白基因单核苷酸多态性研究

目的分析我国云南地区部分HIV-1感染者体内黏合素蛋白基因单核苷酸多态性,为了解我国人群HIV感染与病程进展相关的遗传因素提供基础数据。方法在云南省收集HIV-1感染者静脉血,分离外周血淋巴细胞,提取基因组DNA,PCR扩增目的基因后行Sanger测序,BioEdit软件分析序列以确定多态性位点的存在情况,Haploview v4.2软件确定多态性位点连锁情况。结果获得了来自18个民族的HIV-1感染者体内黏合素蛋白基因序列95条,检出多态性位点19个,频率>5%的位点13个,其中外显子区域6个、内含子区域4个、非翻译区3个;连锁不平衡分析显示符合Hardy-Weinberg平衡分布,g.2170、g.2305、g.2504和g.2770间任意两位点呈高度连锁,g.2305、g.2504、g.2736和g.2770间任意两位点呈高度连锁(r2≥0.8)。统计学分析显示,上述多态性位点与民族、传播途径、CD4细胞计数及病毒载量间无显著相关性。结论首次获得中国人群黏合素蛋白基因多态性数据,为进一步分析其与HIV-1感染及进程的关系奠定了基础。

1例早期HIV感染者外周血抗体变化和病毒基因序列分析

目的:观察HIV早期感染者体内的抗体变化特征,为进一步研究HIV感染早期病毒与宿主的相互作用奠定基础。方法:对一名HIV感染者进行流行病学调查、外周血血清学检测、病毒载量和CD4细胞数检测、体外病毒分离,观察该感染者体内免疫学反应及病毒复制特点。使用巢式PCR方法扩增病毒env区C2-V3区基因,通过测序及序列分析观察病毒部分膜区基因特点。结果:该感染者为早期感染,外周血抗体S/CO值呈逐渐增高趋势,外周血中针对HIV抗原的特异性条带呈逐渐增多趋势,感染183 d后出现针对所有HIV抗原的特异性抗体,病毒载量在感染后3个月时最高(18 000 cp/ml),随后下降,从该感染者外周血中分离的病毒毒力较强。基因序列分析显示该病毒为CRF01_AE亚型,与泰国93TH054毒株基因距离最近。结论:该感染者体内病毒可能起源于泰国毒株,对HIV早期感染的鉴定为研究我国HIV早期感染者体内病毒进化奠定了基础。

狼疮性肾炎并发急性肾损伤的危险因素分析

目的:探讨狼疮性肾炎(LN)并发急性肾损伤(AKI)的相关危险因素。方法:选择LN 168例,调查其并发AKI与发生感染、高血压病、水肿,以及血浆清蛋白、24h尿蛋白定量、血浆同型半胱氨酸、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA(dsDNA)抗体及病理改变情况,分析其相关危险因素。结果:LN 168例并发AKI 47例;AKI组出现水肿、感染、低蛋白血症、高同型半胱氨酸血症,以及肾组织中出现细胞性新月体、毛细血管袢坏死、白金耳、透明血栓的概率均显著高于非AKI组(P<0.05);Logistic多元逐步回归分析结果显示,感染、低蛋白血症、高同型半胱氨酸血症、细胞性新月体形成进入以AKI为因变量的回归方程(P<0.05)。结论:LN并发AKI的危险因素包括感染、低蛋白血症、高同型半胱氨酸血症、细胞性新月体形成等;应针对危险因素采取积极防治措施,以控制病情,延缓肾脏病进展。

1例早期HIV感染者体内病毒准种的各基因片段分析

目的比较1例早期艾滋病病毒(HIV)感染者体内病毒不同基因片段准种复杂度。方法使用套式聚合酶链反应(Nested-PCR),扩增HIV感染者外周血淋巴细胞中病毒的gag、pol、vif-vpr和env区的部分基因,通过克隆、测序方法观察该感染者体内病毒准种分布情况,比较不同基因片段检测病毒准种的可靠性。结果不同基因片段检测病毒准种结果显示,该早期感染者体内的病毒不同基因片段显示的准种基因离散率不同,其中gag区显示出的病毒准种复杂度最高,反映为该区段病毒准种的基因离散率最高,为0·008;其他各区基因(pol、vif-vpr、env)的离散率依次为0·006、0·001、0·000。结论该HIV感染者体内病毒准种的基因中,gag区基因的突变率较高,提示Gag在机体感染HIV早期承受的免疫压力较高,因此在病毒准种研究中,gag区应该作为重要的基因区域。