棉铃虫Ⅰ型和Ⅶ型几丁质酶基因表达规律的比较分析

几丁质酶(chitinase,CHT)在昆虫生长发育过程中主要有降解围食膜、外骨骼、角质层以及肠道内层的几丁质成分,从而参与昆虫的蜕皮和细胞增殖的功能。在本研究中,分析比较了棉铃虫I型和Ⅶ型几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的结构域及其时空表达特性,对进一步功能研究提供重要的素材。首先利用生物信息学在线工具SMART对本课题组前期所获得的几丁质酶基因HaCHT I、HaCHT VII的结构域进行分析;之后采用qRT-PCR方法研究棉铃虫6龄幼虫不同组织和幼虫不同龄期蜕皮前后的中肠中HaCHT I、HaCHT VII的时空表达特性。结果表明:对几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ结构域进行分析,发现HaCHTⅠ和HaCHTⅦ均具有信号肽序列、催化区域、连接区域,且HaCHTⅠ有一个几丁质结合结构域,而HaCHTⅦ则无;棉铃虫Helicoverpa armigera几丁质酶基因HaCHT I和HaCHT VII在6龄幼虫不同组织部位的均有表达,其中HaCHT I在各个部位的表达量没有显著的差异,而HaCHT VII在头壳和体壁中表达显著高于其它组织;几丁质酶基因HaCHT I、HaCHT VII在棉铃虫幼虫蜕皮前后中肠的表达量变化较大,其中HaCHT I在3龄、4龄、5龄、6龄末期及蛹期时的表达量呈递减的趋势,在4龄、5龄、6龄初期时表达量则是先减后增的趋势,而HaCHT VII在3龄、4龄、5龄、6龄末期及蛹期时的表达量呈递增的趋势,恰与同一时期HaCHT I的表达量相反,在4龄、5龄、6龄初期时HaCHT VII的表达量呈递减的趋势。棉铃虫HaCHTⅠ和HaCHTⅦ的结构域和时空表达都存在差异,据此可推测这些差异可能对其功能具有一定的影响。研究结果为深入研究几丁质酶基因HaCHT I和HaCHT VII的功能奠定了基础。

棉铃虫Ⅰ型几丁质酶的表达

昆虫几丁质酶主要参与昆虫蜕皮、围食膜降解、细胞增殖、机体免疫防御、生长因子等重要生理生长发育过程。在本研究中,从NCBI下载棉铃虫几丁质酶序列,并克隆验证正确,构建的系统发育树表明属于Ⅰ型几丁质酶。将不包含信号肽的开放阅读框序列(1 707 bp)与pET28a载体连接,转化至大肠杆菌transetta(DE3)中进行诱导表达,Western blot进一步验证融合蛋白His-HaCHT。用镍柱子纯化融合蛋白,纯化获得的融合蛋白对胶体几丁质有降解活性,其酶活力为0.023 μg/mL·s ^-1 。不同龄期的qPCR结果显示,该基因在棉铃幼虫的 6个幼虫期以及预蛹蜕皮后均有表达,但 HaCHTI 在4龄和6龄幼虫阶段表达相对较高,而在1龄、 2龄、3龄、5龄幼虫和预蛹表达量较低。这些结果表明,异源表达的棉铃虫的I型几丁质酶对胶体几丁质具有降解活性,可能对棉铃虫正常蜕皮有着重要的作用。