仿刺参溶菌酶在重组酿酒酵母中的表达

采用酿酒酵母MKP-0表达仿刺参溶菌酶蛋白(AjLys)。以质粒pMD18-AjLys为模板,PCR扩增将组氨酸标签His-tag克隆到AjLys基因的N末端,构建克隆载体pMD18-His6-AjLys。根据密码子偏好性,通过定点突变对AjLys蛋白第69、77和95位的3个精氨酸的密码子进行优化,得到克隆载体pMD18-His6-AjLys(Δ69,77,95)。经SpeⅠ/BglⅡ酶切,构建重组表达质粒pESC-LEU-His6-AjLys和pESC-LEU-His6-AjLys(Δ69,77,95)。基因工程菌pESC-LEU-His6-AjLys(Δ69,77,95)/MKP-0通过半乳糖诱导72h后,Western Blot检测结果表明其成功表达了AjLys蛋白。抑菌实验结果表明,AjLys蛋白对溶壁微球菌具有一定的抑制作用。本实验成功构建了AjLys的酿酒酵母表达载体,并可在MKP-0细胞中表达了具有活性的AjLys蛋白,为AjLys的生产提供了一种具有可行性的新方法。

海参溶菌酶C端多肽的异构肽酶活性

海参溶菌酶C端多肽与5种异构肽酶的氨基酸残基序列比对发现,其具有较高同源性,维持异构肽酶活性的两个关键位点组氨酸(His)和丝氨酸(Ser)也高度保守。水解底物L-γ-Glu-pNA生成4-硝基苯胺的实验结果表明,C端多肽具有异构肽酶活性。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF能有效破坏蛋白酶活性,表明Ser是异构肽酶rSjLys-C的关键活性位点,即rSjLys-C属于丝氨酸蛋白酶。确定最适催化条件为37℃、pH 7.4、NaCl 50 mmol/L。rSjLys-C的酶促反应动力学参数Vmax为1.446×10^(-5) mmol/(L·s),K_m为0.395 7mmol/L,k_(cat)为1.509×10-3 s^(-1),k_(cat)/K_m为23.813L/(mol·s)。