基于RPA-CRISPR-Cas12a和聚噻吩显色技术快速检测转基因植物外源基因CP4-EPSPS

目的开发基于重组酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated 12a protein,CRISPR-Cas12a)和聚噻吩显色技术快速检测转基因植物外源基因CP4-EPSPS的方法。方法利用Cas12a附属切割机制进行精准识别RPA产物中的靶标,结合阳离子水溶性共轭聚噻吩(cationic water-soluble conjugated polythiophene,PMNT)与体系中单链DNA(single stranded DNA,ssDNA)的颜色变化检测转基因产品中耐除草剂草甘膦CP4-EPSPS抗性基因。结果167 bp的RPA引物进行扩增时,扩增体系为20μL时条带最清晰;ssDNA的碱基数为15,Cas12a酶的浓度为0.28 U为最优组合。进行RPA-CRISPR-Cas12a反应后,加入PMNT溶液,裸眼观察是溶液从红色变为黄色,紫外下照射下则颜色为橘红色变为橙黄色,检出限为45拷贝。结论构建了一种基于PMNT颜色变化进行转基因产品的CRISPR-Cas12a的检测方法,30 min内完成整个检测过程,仅需要恒温加热可实现快速灵敏、可视化的检测。