敲低花生四烯酸5脂加氧酶(Alox5)基因促进K562/ADM细胞凋亡

目的研究短发夹RNA(shRNA)敲低花生四烯酸5脂加氧酶(Alox5)基因对慢性粒细胞白血病耐药细胞K562/ADM细胞凋亡的影响。方法设计并合成3对针对人Alox5基因的靶向shRNA片段,插入到p Genesil-1干扰载体中,经过酶切和测序验证,成功构建p Genesil-1-shRNA-Alox5重组质粒,转染K562/ADM细胞,实时定量PCR和Western blot法检测Alox5 mRNA及蛋白水平,筛选最好干扰组。选择较高干扰效率的p Genesil-1-shRNA-Alox5重组质粒组作为实验组,采用实时定量PCR检测K562/ADM细胞bcr/abl mRNA水平、Western blot法检测BCR/ABL融合蛋白水平、流式细胞术检测细胞凋亡率。结果酶切及测序结果显示重组质粒构建成功。与阴性对照组(p Genesil-1-K562/ADM)和空白K562/ADM细胞组相比,转染p Genesil-1-shRNA-Alox5重组质粒组的K562/ADM细胞Alox5 mRNA和蛋白水平均明显降低。敲低K562/ADM细胞Alox5后,bcr/abl mRNA、BCR/ABL融合蛋白水平均显著降低、细胞凋亡率显著增加。结论敲低Alox5基因后,K562/ADM细胞bcr/abl mRNA和BCR/ABL融合蛋白表达水平下降,细胞凋亡率增加。

miR-30a的高表达促进K562细胞的凋亡

目的:探讨miR-30a的高表达对慢性髓系白血病K562细胞株的促凋亡作用及其机制。方法:构建pEGFP-pre-miR-30a重组质粒并转染K562细胞,采用实时定量PCR法检测miR-30a和BCR/ABL mRNA的表达水平,应用annexinV-FITC/PI双集流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析K562细胞凋亡百分率,应用蛋白印迹法(Western blot)分析BCR/ABL融合蛋白、凋亡相关蛋白BCL-2、BAX及PTEN、AKT、p-AKT的变化。结果:测序与酶切图谱证实成功构建重组质粒。与pEGFP-C1-K562阴性对照组和K562空白对照组比,重组质粒pEGFP-pre-miR-30a转染组miR-30a表达水平显著升高,BCR/ABL mRNA与蛋白表达明显下调,凋亡细胞所占比例明显增加(P<0.05),抗凋亡蛋白BCL-2水平降低,促凋亡蛋白BAX表达增加,抑癌蛋白PTEN表达明显上升,AKT无明显变化,但活性形式的p-AKT显著降低,差异均有统计学意义。结论:高表达的miR-30a能抑制K562细胞癌基因BCR/ABL mRNA及蛋白的表达并促进细胞凋亡,其机制可能与抑制BCR/ABL-PTEN/AKT信号通路的活性有关。