γ-氨基丁酸A型受体β3亚基在2,3,7,8-四氯二苯并二英诱导胎鼠腭裂模型中表达的研究

目的利用2,3,7,8-四氯二苯并二英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)诱导C57BL/6J胎鼠腭裂,检测γ-氨基丁酸A型受体β3亚基(gamma-aminobutyric acidt ype Areceptor beta 3 subunit,GABRB3)在TCDD诱导胎鼠腭裂模型中的表达变化情况,探讨腭裂的发生机制。方法将60只孕鼠按随机数字表法分为实验组和对照组,每组30只。妊娠第10.5天(gestation day 10.5,GD10.5)实验组以28μg/kg的TCDD单次灌胃,对照组以5.6ml/kg玉米油单次灌胃。分别在GD13.5、GD14.5、GD15.5、GD16.5、GD17.5处死孕鼠12只,每组处死6只。行胎鼠腭部形态学和组织学观察;应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测胎鼠腭部组织中GABRB3mRNA及蛋白表达;免疫组织化学及免疫荧光染色检测GABRB3蛋白的表达部位。结果实验组共36只胎鼠,GD17.5腭裂的发生率为100%(36/36);对照组共47只胎鼠,无腭裂发生(0/47)。实验组胎鼠腭突上抬在GD15.5完成,较对照组腭突上抬延迟1d;GD14.5、GD15.5、GD16.5、GD17.5实验组中GABRB3基因mRNA(分别为0.561±0.073、0.728±0.104、0.782±0.137、0.686±0.145)和蛋白表达(分别为0.288±0.013、0.404±0.017、0.399±0.012、0.307±0.010)均显著低于对照组GABRB3基因mRNA(分别为0.818±0.088、0.865±0.086、1.021±0.054、1.163±0.179)和蛋白表达(分别为0.481±0.017、0.456±0.009、0.474±0.016、0.529±0.015)(P<0.05);免疫组化及免疫荧光结果显示,GABRB3主要表达于腭突间质细胞和腭突中嵴上皮缝。结论TCDD诱导胎鼠腭突上抬延迟并最终导致腭裂发生可能与GABRB3降低有关;GABRB3可能在腭部发育的上抬和融合期发挥重要作用。

上皮间充质化在2,3,7,8-四氯二苯二噁英致胎鼠腭突融合障碍中的作用

目的探讨上皮间充质化在2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)致胎鼠腭突融合障碍中的作用。方法将12只C57BL/6 J孕鼠按随机数字表法分为实验组和对照组,每组各6只。妊娠第10.5天(GD10.5),实验组以28μg/kg的TCDD(玉米油溶解)灌胃,对照组则按照等量玉米油灌胃。在GD15.5分别处死2组孕鼠,在显微镜下行胎鼠腭突的形态学观察。购买原代腭突中嵴上皮细胞进行培养,将其分为实验组和对照组,实验组细胞分为3个亚组,分别添加浓度为5、10、20 nmol/L的TCDD于培养基,对照组则使用不加TCDD的培养基。72 h后,通过免疫荧光染色、激光共聚焦检测荧光强度和蛋白质印迹法检测腭突中嵴上皮细胞标志物细胞角蛋白19(CK-19)和腭突间充质细胞标志物波形蛋白(vimentin)的表达。采用单因素方差分析法对各组数据进行比较。结果实验组中共获得36只胎鼠,死胎和吸收胎3只,腭裂发生率为100%(33/33),其中完全腭裂为84.8%(28/33),部分腭裂发生率为15.2%(5/33);对照组中获得40只胎鼠,死胎和吸收胎共2只,腭裂发生率为0(0/38)。实验组和对照组腭突中嵴上皮细胞培养72 h后形态均发生变化,由均一的鹅卵石样变为有伪足的星形或不规则形;对照组和实验组中5、10、20 nmol/L 3个亚组的腭突中嵴上皮细胞标志物CK-19蛋白相对表达量分别为0.739±0.120、0.483±0.023、1.007±0.109、1.086±0.145,荧光强度分别为53.384±5.785、36.818±8.250、64.575±8.323、76.898±3.711;腭突间质细胞标志物vimentin蛋白相对表达量分别为0.527±0.112、0.781±0.095、0.284±0.046、0.216±0.040,荧光强度分别为63.672±6.135、82.632±4.474、52.608±7.525、42.664±7.659。低剂量实验组(5 nmol/L)与对照组相比,CK-19降低而vimentin升高;高剂量实验组(10、20 nmol/L)与对照组相比,CK-19升高而vimentin降低,差异有统计学意义(P<0.05),高剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论腭突中嵴上皮细胞间充质化(EMT)可能是一自发程序,TCDD致腭突融合障碍可能与腭突中嵴上皮细胞EMT过程受抑制有关,且随着TCDD剂量增加,这种抑制作用保持稳定。