马氏珠母贝丝裂原活化蛋白激酶p38的克隆与表达

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白激酶通过磷酸化级联介导的信号通路在细胞对细胞外刺激的反应中起着重要作用。本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得马氏珠母贝MAPK p38(PmMAPK p38)cDNA全长序列并对其序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了PmMAPK p38在马氏珠母贝不同组织以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示,PmMAPK p38 cDNA全长为1516 bp,开放阅读框长度为1071 bp,共编码356个氨基酸,理论分子量为40.88 ku;结构域预测结果表明PmMAPK p38含有MAPK家族典型的S_TKc结构域;多序列比对、进化树构建以及MatGAT计算结果显示PmMAPK p38与其他物种的相似度、保守程度较高;荧光定量分析结果表明,该基因在马氏珠母贝中存在广泛表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为外套膜,最低是闭壳肌。马氏珠母贝在受到LPS刺激后,PmMAPK p38的相对表达量在刺激后2 h达到最高,12 h降到最低,最高约为最低的5倍;而在哈维氏弧菌刺激后,PmMAPK p38的相对表达量在2 h达到最高,8 h降到最低,最高约为最低的4倍。研究表明,PmMAPK p38可能在马氏珠母贝的免疫反应,尤其是在抵御外部细菌侵入中起着重要的作用。本研究为贝类免疫防御系统的研究提供了基础资料。

涡轮叶片的网格参数化方法及其寿命可靠性优化

涡轮叶片的寿命可靠性优化对保障发动机安全,提高发动机使用寿命具有重要意义。传统的确定性优化由于没有考虑不确定性因素的影响,其结果往往导致结构可靠性低,严重威胁发动机的安全。针对复杂的含气膜孔几何变量的涡轮叶片几何构型,提出局部参数化网格变形方法,在关注的叶片前缘部分采用六面体网格,并利用局部网格变形法实现其参数化变形,其他部分采用四面体网格,以缩短其网格划分时间,提高其网格划分效率。所提方法实现了不确定条件下的含气膜孔几何变量涡轮叶片的寿命可靠性优化,在满足可靠性约束和几何约束的条件下,使得涡轮叶片基于不确定性的寿命均值提高了18.36%。

马氏珠母贝血清抗菌肽的初步分析

马氏珠母贝(Pinctada martensii)是生产海水珍珠的主要经济贝类,近年来马氏珠母贝因病害频繁发生而对我国珍珠产业造成巨大的经济损失。因此,对于马氏珠母贝的免疫机制研究尤为重要。抗菌肽是贝类生物免疫机制中最重要的一个环节,但目前对马氏珠母贝抗菌肽的报道甚少。为深入了解马氏珠母贝的抗菌肽分子组成及特征,本实验采取多步高效液相色谱结合质谱分析,对马氏珠母贝血清中具有抗菌活性的蛋白质分子开展了分离纯化及鉴定研究,得到了5种有明显抗菌活性的蛋白,其中3种相对分子质量在5 000 k D左右;通过透射电镜进一步观察了抗菌活性蛋白对细菌的作用机制。上述研究为了解马氏珠母贝抗菌肽的分子多样性及抗菌机制奠定了基础。

马氏珠母贝TRA F7基因cDNA的克隆及表达分析

肿瘤坏死因子受体相关因子7(TRA F7)属于TRAFs家族,参与多种免疫炎症反应。为了研究马氏珠母贝TRAF7(PmTRA F7)的生物学功能,本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmTRA F7基因cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析;同时利用荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测了马氏珠母贝不同组织中PmTRA F7基因mRNA的表达。结果显示,PmTRA F7基因cDNA全长2246bp,开放阅读框(ORF)1809bp,编码602个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长211bp,3'非翻译区(3'UTR)长226bp,预测分子量约为67.50kD,理论等电点为6.56。多序列比对结果发现软体动物间TRA F7具有高保守性。软件分析结果显示PmTRA F7的氨基酸序列具有典型的RING结构、锌指结构和7个重复的WD40序列。荧光定量数据分析表明,PmTRA F7基因在全组织中均有表达,在肝胰腺中表达量最高,外套膜和鳃中表达量也较高。

马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）新型清道夫受体基因克隆与表达分析

清道夫受体（scavenger receptors,SRs）作为一类先天性免疫受体,在宿主固有免疫防御中起着重要的作用。本研究采用RACE技术首次从马氏珠母贝c DNA文库中克隆出一个新型的马氏珠母贝SR基因全长序列（pmSR）,并且运用qRT-PCR技术检测了pmSR基因在马氏珠母贝不同组织中的表达情况和哈维氏弧菌刺激后在血淋巴中的时序表达模式。结果显示,PmSR基因序列全长为954 bp,5＇UTR长为107 bp,3＇UTR长为169 bp,开放阅读框为678 bp,其编码225个氨基酸;PmSR氨基酸序列含有α卷曲螺旋结构和具有6个保守的半胱氨酸的SRCR域（scavenger receptor cystein rich domain）,具有A型SRCR结构域的典型特征。SRCR结构域氨基酸序列多序列比对显示Pm SR的SRCR结构域与老鼠和斑马鱼MARCO（macrop Hage receptor with collagenous structure,MARCO）SRCR相似度最高,分别为44%和43%;且蛋白质聚类分析表明PmSR与SR-AI（class A scavenger receptor I,SR-AI）同源性最高。qRT-PCR结果显示,PmSR基因在马氏珠母贝闭壳肌、肝胰腺、血细胞、外套膜、性腺、鳃中均有表达,在肝胰腺表达量最高;哈维式弧菌（Vibrio harveyi）刺激后,血淋巴中PmSR基因表达量在0-8 h逐渐上升,并于8 h达到最大表达量,约为对照组（0 h）的4.2倍,表达量随后下降,直至16 h后,其表达量再次出现显著性上升,结果具有显著性差异（p〈0.05）。本研究为贝类免疫防御系统的研究提供了重要资料。

马氏珠母贝NR1基因的克隆、序列分析与表达研究

N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受体属于是一类离子型谷氨酸受体,并且与脊椎动物和无脊椎动物的突触可塑性,记忆采集和学习等密切相关。本研究采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得了马氏珠母贝（Pinctada martensii） NR1型受体基因（PmNR1） cDNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR （qRT-PCR）技术检测了PmNR1在马氏珠母贝各组织中的表达谱和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激后肝胰脏中的表达模式。结果显示,PmNR1 cDNA全长2 969 bp,其中5＇非编码区（UTR）长95 bp,3＇UTR长42 bp,开放阅读框（ORF）长2 382 bp,编码943个氨基酸;Pm NR1含有信号肽,两个配体结构域,一个预测的甘氨酸和谷氨酸结合位点,三个跨膜域,以及一个发夹式结构域,一个NR1亚基的钙调蛋白结合结构域;多序列比对结果表明物种间NR1具有较高的保守性,且与长牡蛎的相似度达61.19%。qRT-PCR结果表明,PmNR1在马氏珠母贝实验组织中都有表达,在肝胰脏、鳃、性腺和外套膜中表达量较高（p〈0.05）;LPS刺激后肝胰脏中PmNR1基因表达量在4 h逐渐下降,并于8 h达到最低表达量,约为对照组（0 h）的2.6倍,随后的12～24 h表达量开始回升,并于24 h恢复到原有水平,结果具有显著性差异（p〈0.05）。

马氏珠母贝DcpS基因的分子特征与表达分析

清道夫脱帽酶(DcpS)是一种mRNA脱帽酶,与基因表达调控、呼吸、运动神经元活动,癌症和各种应激反应紧密相关。本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了马氏珠母贝DcpS(Pm Dcp )基因cDNA全长序列;运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测Pm DcpS基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。结果显示,Pm DcpS基因序列全长1 034 bp,其中开放阅读框(ORF)为975 bp,编码324个氨基酸,5'非编码区(5'UTR)长为25 bp,3'非编码区(3'UTR)长为34 bp,包含29 bp的poly A。预测分子量约为37.94 k D,理论等电点为6.12。序列分析发现Pm DcpS具有典型DcpS结构域。多序列比对结果表明物种间DcpS具有较高的保守性,与太平洋牡蛎的相似性为65.6%。实时荧光定量PCR数据分析表明,该Pm DcpS基因在马氏珠母贝性腺、鳃、肝胰腺、血细胞、闭壳肌、外套膜边缘区、外套膜中央区这7种组织中均有表达,其中在外套膜中央区和肝胰腺表达量较高。本研究可为进一步探究Pm DcpS在贝类中的生物学功能提供重要的理论基础和参考价值。