弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

目的 构建原核重组表达质粒pET2 3a SAG2 ,并在大肠埃希菌中实现高效表达 ,以及检测表达产物的抗原性。 方法 PCR扩增SAG2编码基因目的片段 ,琼脂糖凝胶电泳回收纯化 ,克隆至 pMD18 T载体 ,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体 pET2 3a ,构建重组表达质粒 pET2 3a SAG2 ,转化大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆 ,经限制性酶切分析鉴定后 ,转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)与免疫印迹分析表达产物。 结果 PCR扩增出约 5 0 0bp的SAG2编码基因目的片段 ,与预期片段大小相符 ,经测序鉴定无基因突变 ;所构建的 pET2 3a SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定 ,与预期结果一致 ;含有pET2 3a SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL2 1(DE3 )诱导后得到了高效表达 ,SDS PAGE显示表达产物约Mr 190 0 0 ;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性。 结论 成功构建了pET2 3a SAG2表达质粒 ,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达 ;表达产物具有良好的抗原性。

SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化

目的克隆SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列,构建原核重组表达质粒pET23a-M,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达、纯化。表达产物用Western Blot检测其抗原性。方法RT-PCR扩增M编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α。序列测定后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组体pET23a-M,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,以限制性酶切分析鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物。结果PCR扩增出约675bp的特异性片段,与预期片段大小相符,测序鉴定无有义突变;所构建的pET23a-M重组体阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE显示表达产物约27kD;表达产物经金属螯和层析纯化;免疫印迹表明表达产物能被混合的SARS病人恢复期血清识别。结论成功克隆了SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列,构建了pET23a-M表达质粒,诱导表达并纯化出了SARS冠状病毒M蛋白,并以免疫印迹鉴定。本研究的成功为进一步进行SARS病毒诊断试剂与疫苗的开发奠定了基础。

武汉大东湖水网构建工程对生物多样性影响研究

由于江湖通道隔截,武汉大东湖各湖泊变得相对"孤立",水质污染严重,生物多样性明显下降,为此,武汉市实施了大东湖水网构建工程,将长江与大东湖各湖泊连通起来。根据大东湖目前的污染现状、工程引水规划以及长江和东湖的水质和水生生物情况,分析了工程实施对湖泊生境、水生生物、鱼类及鸟类的影响。工程的实施,将增强水体的流动性、提高湖泊的水体置换能力、减少死水区、扩大湖泊环境容量,为水生生物多样性的恢复创造适宜的生境。

长江流域生态敏感区信息共享平台建设探讨

长江流域分布有大量的生态敏感区,对维持流域生物多样性和保障流域生态安全具有重要战略意义。但由于缺乏流域生态敏感区信息共享平台,在流域开发规划上,难以表达生态敏感区保护信息。在分析流域生态敏感区信息共享现状及存在主要问题的基础上,辨析了生态敏感区信息共享不完善对流域规划决策的制约影响,构思了信息共享平台建设的指导思想、设计原则及总体框架结构。该平台建设有利于推进流域信息化建设进程,提高流域的规划、管理、决策、科技创新水平及工作效率。

弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

构建原核重组表达质粒pET23a-SAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性.PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α.测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET23a-SAG2,转化大肠埃希菌DH5α.筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析表达产物.PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23a-SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET 23a-SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr 19 000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性.成功构建了pET 23a-SAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性.……

人外周血IL-12 P35 cDNA的巢式PCR扩增、克隆与测序

目的 克隆中国汉族人IL -12P3 5cDNA序列 ,并进行序列测定。 方法 利用反转录巢式PCR从健康人外周血总RNA中扩增IL -12P3 5cDNA序列 ,插入T载体PMD -T中 ,重组质粒转化大肠杆菌JM10 9,所获克隆经PCR初筛后进行酶切鉴定 ,阳性克隆进行DNA测序。 结果 从健康人外周血总RNA中扩增出约 670bp条带 ,与预期大小相同 ,PCR与酶切鉴定证明得到PMD/P3 5阳性克隆 ,DNA测序证实了插入片段的正确性。 结论 在体外成功的扩增、克隆了中国汉族人IL -12P3 5cDNA序列。为继续开展IL -12的基础与应用研究奠定了基础。

物理楔形野两种处方剂量计算方法的对比实验研究

目的比较物理楔形野两种不同方法计算处方剂量与实测值的偏差,为物理楔形野处方剂量计算提供参考。方法在SIEMENS Primus-M型医用加速器产生的6MV X线和15MV X线条件下,用SCAN-DITRONIX RFA300三维水箱采集处方剂量计算所需的各种物理数据,2种方法分别计算处方剂量,与NEFarmer2670剂量仪实测值进行比较。结果传统方法计算值与实测值偏差较大,在6MV X线、45°楔形板、25cm×25cm射野、20cm深度条件下偏差达9.1%,而改进方法计算值与实测值偏差不超过1.2%。结论物理楔形野处方剂量计算的传统方法在某些条件下存有较大误差,建议完善物理楔形野处方剂量计算所需相关物理数据,采用改进方法进行计算。

弓形虫RH株SAG2基因片段的克隆、表达、纯化与鉴定

克隆弓形虫RH株膜表面抗原2(SAG2)编码基因,构建原核重组表达质粒PET23a-SAG2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达及纯化SAG2蛋白.PCR扩增503bp的SAG2编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.限制性酶切分析及测序鉴定后以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD-18T-SAG2质粒与表达质粒载体Pet23a的BamHⅠ和SalⅠ多克隆位点,构建重组体Pet23a-SAG2,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,以限制性酶切分析鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.表达产物经金属鏊合层析纯化.用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达与纯化产物.PCR扩增出约503bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符;所构建的PET23a-SAG2重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定,与预期结果一致.SDS-PAGE与免疫印迹显示,表达产物约18kD.成功构建PET23a-SAG2表达质粒,诱导表达并纯化出了弓形虫RH株SAG2蛋白,并以免疫印迹鉴定.……

弓形虫SAG2/GST融合蛋白在E.coli中的表达条件的研究与纯化

提高弓形虫SAG2/GST融合蛋白在在E.coli中的表达水平并纯化.对诱导温度、诱导物浓度与诱导时间等条件与目的蛋白在细菌裂解上清中的表达量的关系进行了研究.在表达条件优化后,大量制备目的蛋白利用GlutathioneSepharose 4B亲和层析进行初步纯化.纯化产物进一步切胶回收纯化.SAG2/GST融合蛋白在37℃,以0.2mMIPTG诱导4小时后在细菌裂解上清中的表达量最高.SAG2/GST融合蛋白在亲和层析后得到初步纯化并在切胶回收后得到电泳纯的SAG2/GST融合蛋白.获得了SAG2/GST融合蛋白在E.coli的最佳表达条件.得到了两种纯度的SAG2/GST融合蛋白.为进一步研制弓形虫重组抗原疫苗、弓形虫免疫诊断试剂及单克隆抗体提供了基础.……

SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化

克隆SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列,构建原核重组表达质粒PET23a-M,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达、纯化.表达产物用WesternBlot检测其抗原性.RT-PCR扩增M编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.……

鼻咽癌旋转调强放射治疗与固定野动态调强放射治疗的剂量学比较

目的:比较旋转调强(intensity-modulated arc radiotherapy,IMAT)与固定野动态调强(dynamic intensity-modulated radiation therapy,dIMRT)在鼻咽癌放射治疗计划中的剂量学差异。方法:随机选取25例鼻咽癌患者的定位CT影像,分别采用IMAT和dIMRT方式设计同步推量放射治疗计划。比较两种计划的平均剂量体积直方图(dosevolume histogram,DVH)、靶区、危及器官和正常组织的剂量、机器跳数和治疗时间。结果:IMAT的95%靶体积受到的剂量(D95)与dIMRT差异无统计学意义(P>0.05),总体上的靶区平均剂量(Dmean)、最大剂量(Dmax)和受照107%以上处方剂量的体积(V107%)高于dIMRT(P<0.05);脊髓、视神经、晶体、颞颌关节等危及器官的剂量学指标两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。脑干IMAT的Dmax高于dIMRT(P<0.05)。左、右腮腺IMAT的Dmean和50%腮腺体积的受照剂量(D50)高于dIMRT(P<0.05)。IMAT受照小于800 cGy的正常组织体积[定义为体表轮廓区域的体积减去计划靶体积(planning target volume,PTV),用B-P表示]高于dIMRT(P<0.05),受照1200～4500 cGy的体积比dIMRT低(P<0.05)。IMAT比dIMRT的单次总机器跳数平均减少了62.7%,单次治疗时间平均减少了60.1%。结论:两种计划剂量学存在一定差异,但都能满足临床要求。IMAT减少了正常组织受量,显著降低了机器跳数,大大缩短了治疗时间。

厄瓜多尔流域综合规划适宜生态流量研究

在厄瓜多尔水资源管理工作中,生态流量管控尚未被应用于具体实践。为此,参考中国的水资源保护管理经验,将生态流量管控作为水资源保护的重要手段引入厄瓜多尔流域综合规划中。在对生态流量发展历史、计算方法和应用情况进行系统总结和分析的基础上,根据厄瓜多尔基础资料现状情况及管理要求,在制定水资源保护规划时,确定了212个生态流量控制断面,并应用Tennant法和流量历时曲线法计算了各控制断面的生态流量。

退耕还林对农户经济影响的分析——以陕西省吴起县为例

以陕西省吴起县为例,通过对1 619户农户的全面调查,了解农民对退耕还林政策的态度,系统分析了退耕还林工程的实施对当地农民的经济收入、行为方式、种植业、畜牧养殖业以及产业结构的影响,结果表明:退耕还林不仅使当地农民受惠,而且促进了该县农村经济结构的调整和区域经济的发展。

SARS冠状病毒S蛋白部分序列2的克隆与表达

目的 构建SARS冠状病毒棘突蛋白部分序列 2 (S2 )的原核表达质粒 ,分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法 采用逆转录聚合酶链式反应技术从SARS冠状病毒基因组中扩增出编码S蛋白的第 2 170到 2 814位碱基的基因片段 ,克隆至 pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序。用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pGEX - 4T - 2 ,转化大肠杆菌JM10 9,PCR和双酶切鉴定转化菌落。将阳性菌落经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达。结果 RT -PCR扩增出S2特异片段 ,经测序与GenBank比对存在 1处碱基突变。S2基因片段亚克隆至表达载体 pGEX - 4T - 2构建成重组表达质粒 ,并在JM 10 9中表达了S2融合蛋白。结论 成功构建了SARS冠状病毒S2的重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中表达了S2融合蛋白。

弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。

弓形虫表面抗原SAG1 DNA疫苗的构建

目的 构建真核重组表达质粒 pVAX1-SAG1,并探讨其诱导的体液免疫应答。 方法 采用多聚酶链反应技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断 ,并克隆至载体pMD18-T ,经菌落PCR鉴定和测序分析后 ,亚克隆至真核表达载体 pVAX1,构建重组真核表达质粒pVAX1-SAG1,并予菌落PCR和双酶切鉴定。以此为疫苗候选分子免疫小鼠 ,检测其诱导产生的抗体。结果 PCR扩增出SAG1基因的截短型片段 ,其大小约 780bp ;测序的阳性TA克隆除两处发生同义突变外 ,其余序列与原序列一致 ;TA克隆的插入片段被亚克隆到真核表达载体 pVAX1,构建了重组表达质粒pVAX1-SAG1;该质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。 结论 成功构建了弓形虫表面抗原SAG1的DNA疫苗。

弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究

目的用pVACGRA4真核表达重组质粒免疫小鼠,观察诱导的免疫应答及对弓形虫感染的保护作用。方法大量制备pVACGRA4真核表达重组质粒,经基因枪腹部皮内注射免疫BALB/c小鼠3次,以pVAC空质粒及不经任何处理的空白组为对照。于末次免疫4周后作免疫指标测定(包括MTT法测定小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性、间接免疫荧光法测定T淋巴细胞亚群数目、双夹心ELISA法测定细胞因子IFNγ及IL4含量、间接ELISA法测定IgG抗体滴度),并观察攻毒试验后小鼠存活情况。结果脾淋巴细胞增殖各组间差异无显著性(P>0.05);pVACGRA4组CD4+T细胞百分率无明显变化(P>0.05),CD8+T细胞百分率明显增加(与pVAC对照组比较P<0.05,与空白对照组比较P<0.01),CD4+/CD8+比值也较空白对照组明显降低(P<0.01);pVACGRA4免疫组IFNγA值比对照组略高,但差异无显著性(P>0.05),IL4A值各组间无明显变化(P>0.05);pVACGRA4组可诱导产生特异性IgG抗体,但滴度不高;pVACGRA4免疫组小鼠存活率显著高于两对照组,死亡小鼠的平均存活时间延长(与空白对照组比较P<0.05)。结论用pVACGRA4重组质粒DNA免疫小鼠,可诱导产生以细胞免疫为主的免疫应答及对弓形虫攻击感染的部分保护作用。

洞庭湖区土地覆被对长江水位变化的响应分析

为了研究长江水位的变化对洞庭湖区土地覆被的影响,基于洞庭湖区近26 a土地覆被遥感影像的解译成果,分别构建了东洞庭湖区和西+南洞庭湖区水域、泥滩、草洲、芦苇地、裸地和防护林面积与对应时段城陵矶水位之间的回归方程。分析结果显示:东洞庭湖区水域、泥滩、草洲面积和西+南洞庭湖区水域面积与城陵矶水位之间具有极显著的相关关系,而芦苇地、裸地和防护林等面积与城陵矶水位之间的关系并不显著;城陵矶水位变化对东洞庭湖区土地覆被的影响明显高于对西+南洞庭湖区土地覆被的影响。此外,依据所构建回归方程,预测长江上游大型梯级电站运行将导致洞庭湖区呈现泥滩和草洲挤占水域的态势。

长江流域珍稀濒危和国家重点保护植物综述

根据众多研究者对长江流域19省(自治区、直辖市)珍稀濒危植物和国家重点保护植物已有研究结果,结合1991年《中国植物红皮书(第一册)》和1999年8月国务院批复的《国家重点保护野生植物名录(第一批)》,对长江流域珍稀濒危植物和国家重点保护植物资源进行了统计与分析。结果表明,长江流域珍稀濒危植物60科109属154种,占全国珍稀濒危植物种类的39.7%,其中蕨类植物9科9属10种,裸子植物7科23属38种,被子植物44科77属106种;长江流域国家重点保护植物126种,其中Ⅰ级31种,Ⅱ级95种。分析了长江流域珍稀植物和国家重点保护植物的分布特点及保护现状,提出了相应的保护措施。

弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒,并研究其在体外与体内细胞中的表达情况。方法采用PCR方法及克隆技术,构建pVACGRA4重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK293细胞,用RTPCR法及Westernblot法检测其表达情况;利用基因枪导入法将该重组质粒导入BALB/c小鼠体内细胞,测定免疫鼠T淋巴细胞亚群及IFNγ、IL4含量,并观察攻毒试验后小鼠存活情况,以评价其免疫保护力。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段,成功构建重组表达质粒pVACGRA4;转染GRA4的HEK293细胞,RTPCR检测可见一条约987bp的目的条带,表达产物经Westernblot鉴定,其分子量约为41kD,能被特异性免疫血清所识别;经pVACGRA4免疫后的小鼠,其CD+4T细胞百分率无明显变化(P>0.05),CD+8T细胞百分率明显增加(与pVAC对照组比较P<0.05,与空白对照组比较P<0.01),CD+4/CD+8比值也较空白对照组明显降低(P<0.01);pVACGRA4免疫鼠IFNγ的A值比对照组略高,但差异无显著性(P>0.05),IL4A值各组间无明显变化(P>0.05);pVACGRA4免疫鼠存活率显著高于两对照组,死亡小鼠的平均存活时间延长(与空白对照组比较P<0.05)。结论构建的真核表达质粒pVACGRA4能在HEK293细胞中和小鼠体内细胞中表达,为弓形虫疫苗的进一步研究打下基础。