期刊导航
期刊开放获取
河南省图书馆
退出
期刊文献
+
任意字段
题名或关键词
题名
关键词
文摘
作者
第一作者
机构
刊名
分类号
参考文献
作者简介
基金资助
栏目信息
任意字段
题名或关键词
题名
关键词
文摘
作者
第一作者
机构
刊名
分类号
参考文献
作者简介
基金资助
栏目信息
检索
高级检索
期刊导航
共找到
1
篇文章
<
1
>
每页显示
20
50
100
已选择
0
条
导出题录
引用分析
参考文献
引证文献
统计分析
检索结果
已选文献
显示方式:
文摘
详细
列表
相关度排序
被引量排序
时效性排序
靶向非洲猪瘟病毒EP152R基因sgRNA细胞系的构建及其对ASFV复制影响的研究
被引量:
1
1
作者
皇甫皓月
雷薪霖
+9 位作者
席飞
黄炼榆
王可欣
沈冬冬
张纪文
张振江
李芳
步志高
殷昊
赵东明
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第5期452-458,共7页
有报道证实,缺失重要功能基因EP152R的非洲猪瘟病毒(ASFV)不能有效复制。为了筛选靶向ASFV EP152R基因的小向导RNA(sgRNA),分析EP152R基因对ASFV复制的影响,本研究利用簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)核酸酶系...
有报道证实,缺失重要功能基因EP152R的非洲猪瘟病毒(ASFV)不能有效复制。为了筛选靶向ASFV EP152R基因的小向导RNA(sgRNA),分析EP152R基因对ASFV复制的影响,本研究利用簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)核酸酶系统(CCTop)并利用猪的基因组作为脱靶对象设计并筛选靶向ASFV EP152R基因(72387nt~72845nt)的sg RNA,并采用非随机整合报告系统(TIDE)计算各对sg RNA的编辑效率确定最佳sg RNA。结果显示,筛选了5对靶向敲除ASFV EP152R基因的sg RNA,其中3对sg RNA对EP152R基因的编辑效率达30%~42%,另外两对sg RNA的编辑效率低于10%。将筛选的3对sg RNA退火后分别克隆至p-LentiCRISPRv2载体中,构建3个重组慢病毒质粒p-LentiCRISPRv2-gREP152R-1/2/3,并采用菌液PCR及测序鉴定正确后分别与2个辅助质粒共转染HEK293T细胞,72 h后获得各慢病毒并分别感染野猪肺细胞(WSL细胞),通过嘌呤霉素筛选表达各sg RNA的细胞WSL-g REP152R,并采用western blot鉴定。结果显示,构建的各细胞在40 ku处均出现特异性条带,而WSL细胞无该条带,表明正确构建表达3种EP152R sg RNA的细胞系WSL-g REP152R-1/2/3。将携带m Cherry报告基因的重组ASFV(mCherry-ASFV)以MOI 1感染各WSL-g REP152R细胞系,分别于不同时间观察荧光;收集各细胞上清液,采用荧光定量PCR(qPCR)检测ASFV P72基因的Ct值,并测定上清液中的病毒效价(感染后72 h)。观察结果显示,随感染时间的延长WSL-g REP152R-2/3中的红色荧光均明显减少;WSL-g REP152R-1及空白对照WSL细胞中的红色荧光则逐渐增多,但前者的红色荧光均少于后者。q PCR和TCID50测定结果显示,与空白对照WSL细胞相比,3种WSL-g REP152R细胞上清液中病毒扩增的Ct值均显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01),而病毒效价均显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01),且以WSL-g REP152R-2中的病毒效价最低。将m Cherry-ASFV感染各WSLg REP152R细胞并连续传3代,采用q PCR检测F2、F3代细胞上清液中的病毒扩增的Ct值。结果显示,与WSL细胞相比,各WSL-g REP152R细胞F2代上清液中ASFV扩增的Ct值均极显著升高(P<0.01),且WSL-g REP152R-2 F2代及WSL-g REP152R-1/2 F3代细胞上清液中均检测不到病毒扩增的Ct值。上述结果表明,本研究设计的sg RNA能够有效靶向ASFV EP152R基因并敲除该基因进而抑制ASFV及其子代病毒的复制,且g REP152R-2抑制ASFV复制的效果最好。本研究为ASFV疫苗的开发及抗ASF育种猪提供重要参考数据。
展开更多
关键词
非洲猪瘟病毒
簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9
EP152R
g
RNA
下载PDF
职称材料
题名
靶向非洲猪瘟病毒EP152R基因sgRNA细胞系的构建及其对ASFV复制影响的研究
被引量:
1
1
作者
皇甫皓月
雷薪霖
席飞
黄炼榆
王可欣
沈冬冬
张纪文
张振江
李芳
步志高
殷昊
赵东明
机构
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室
武汉大学医学研究院
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第5期452-458,共7页
基金
兽医生物技术国家重点实验室自主课题(SKLVBP202101)。
文摘
有报道证实,缺失重要功能基因EP152R的非洲猪瘟病毒(ASFV)不能有效复制。为了筛选靶向ASFV EP152R基因的小向导RNA(sgRNA),分析EP152R基因对ASFV复制的影响,本研究利用簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)核酸酶系统(CCTop)并利用猪的基因组作为脱靶对象设计并筛选靶向ASFV EP152R基因(72387nt~72845nt)的sg RNA,并采用非随机整合报告系统(TIDE)计算各对sg RNA的编辑效率确定最佳sg RNA。结果显示,筛选了5对靶向敲除ASFV EP152R基因的sg RNA,其中3对sg RNA对EP152R基因的编辑效率达30%~42%,另外两对sg RNA的编辑效率低于10%。将筛选的3对sg RNA退火后分别克隆至p-LentiCRISPRv2载体中,构建3个重组慢病毒质粒p-LentiCRISPRv2-gREP152R-1/2/3,并采用菌液PCR及测序鉴定正确后分别与2个辅助质粒共转染HEK293T细胞,72 h后获得各慢病毒并分别感染野猪肺细胞(WSL细胞),通过嘌呤霉素筛选表达各sg RNA的细胞WSL-g REP152R,并采用western blot鉴定。结果显示,构建的各细胞在40 ku处均出现特异性条带,而WSL细胞无该条带,表明正确构建表达3种EP152R sg RNA的细胞系WSL-g REP152R-1/2/3。将携带m Cherry报告基因的重组ASFV(mCherry-ASFV)以MOI 1感染各WSL-g REP152R细胞系,分别于不同时间观察荧光;收集各细胞上清液,采用荧光定量PCR(qPCR)检测ASFV P72基因的Ct值,并测定上清液中的病毒效价(感染后72 h)。观察结果显示,随感染时间的延长WSL-g REP152R-2/3中的红色荧光均明显减少;WSL-g REP152R-1及空白对照WSL细胞中的红色荧光则逐渐增多,但前者的红色荧光均少于后者。q PCR和TCID50测定结果显示,与空白对照WSL细胞相比,3种WSL-g REP152R细胞上清液中病毒扩增的Ct值均显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01),而病毒效价均显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01),且以WSL-g REP152R-2中的病毒效价最低。将m Cherry-ASFV感染各WSLg REP152R细胞并连续传3代,采用q PCR检测F2、F3代细胞上清液中的病毒扩增的Ct值。结果显示,与WSL细胞相比,各WSL-g REP152R细胞F2代上清液中ASFV扩增的Ct值均极显著升高(P<0.01),且WSL-g REP152R-2 F2代及WSL-g REP152R-1/2 F3代细胞上清液中均检测不到病毒扩增的Ct值。上述结果表明,本研究设计的sg RNA能够有效靶向ASFV EP152R基因并敲除该基因进而抑制ASFV及其子代病毒的复制,且g REP152R-2抑制ASFV复制的效果最好。本研究为ASFV疫苗的开发及抗ASF育种猪提供重要参考数据。
关键词
非洲猪瘟病毒
簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9
EP152R
g
RNA
Keywords
African swine fever virus
CRISPR-Cas9
EP152R gene
gRNA
分类号
S852.65 [农业科学—基础兽医学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
靶向非洲猪瘟病毒EP152R基因sgRNA细胞系的构建及其对ASFV复制影响的研究
皇甫皓月
雷薪霖
席飞
黄炼榆
王可欣
沈冬冬
张纪文
张振江
李芳
步志高
殷昊
赵东明
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023
1
下载PDF
职称材料
已选择
0
条
导出题录
引用分析
参考文献
引证文献
统计分析
检索结果
已选文献
上一页
1
下一页
到第
页
确定
用户登录
登录
IP登录
使用帮助
返回顶部