树鼩角膜基质永生化细胞系的构建及其在病毒感染性方面的研究

目的建立树鼩永生化角膜基质细胞(corneal stromal cells,CSCs)系,并探讨其在病毒感染中的应用。方法利用组织块贴壁培养法分离培养树鼩原代CSCs,将携带SV40T基因的慢病毒转染细胞后,再挑取单克隆进行传代培养,传至50代以上进行形态学观察并与40代细胞形态进行比较,波形蛋白(vimentin)和SV40T基因免疫荧光鉴定、核型鉴定、细胞增殖曲线测定。用单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)(McKrae株)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)(GZ01株)、登革病毒Ⅱ型以及甲型流感病毒H1N1(PR8株)在该细胞上进行病毒感染实验。结果传至50代以上的树鼩永生化CSCs呈梭形,细胞形态结构与40代相比仍较好。vimentin和SV40T基因免疫荧光表达阳性。增殖曲线结果显示:细胞生长旺盛,第4~5天时处于对数生长期。原代细胞核型的染色体数稳定为62条,而永生化细胞第21、56代突变为64条且保持稳定。病毒感染实验显示:树鼩永生化CSCs对HSV-1(McKrae株)、ZIKV(GZ01株)、登革病毒Ⅱ型以及H1N1(PR8株)病毒敏感,产生较高感染滴度,分别为1.32×105、5.62×106、2.69×107、7.76×104CCID50/mL。结论成功建立了树鼩永生化CSCs细胞系,提示该细胞系可用于单纯疱疹病毒、寨卡病毒、登革病毒和甲型流感病毒感染眼角膜疾病的作用机制及抗病毒药物的研究。

树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株的建立及鉴定

目的建立树鼩视网膜来源的微血管内皮细胞的体外分离培养技术以及永生化细胞株,为体外利用树鼩视网膜微血管内皮细胞开展相关研究提供新的实验材料。方法利用Ⅱ型胶原酶、分散酶和DNaseⅠ酶消化法分离培养出原代视网膜微血管内皮细胞,利用差速消化法纯化内皮细胞,然后利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞,再挑取单克隆后进行传代培养。对传至50代以上的细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定以及核型鉴定。结果采用混合酶消化法能够分离获得微血管内皮细胞,纯化后的细胞呈不规则多角形和梭形。经慢病毒转染后的细胞传代培养后细胞形态一致,到第50代时细胞形态结构仍较好。细胞免疫荧光结果显示标志性蛋白VWF、CD34、Claudin1、ZO-1和永生化SV40T表达阳性。生长曲线结果显示:细胞生长旺盛,第2~4天时处于对数生长期,第4天进入平台期。细胞核型结果显示:染色体数与树鼩染色体相同,即所获取的细胞为永生化的树鼩视网膜微血管内皮细胞。结论成功建立的树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株具有较好的形态结构与功能,为视网膜病变及眼科相关疾病的研究提供了新的实验材料。

树鼩眼球组织形态学结构特征与比较分析

目的获得树鼩眼球组织形态学结构特征,并比较树鼩、恒河猴和人类眼球组织解剖学的异同点,为利用树鼩建立眼部相关疾病模型提供必要的组织学基础数据。方法制作树鼩和恒河猴眼球常规石蜡切片,HE染色后进行分析比较。结果树鼩眼球主要由晶状体和眼球壁组成。眼球壁分3层,由外向内依次为纤维膜、血管膜和视网膜三层。纤维膜前方1/6为角膜,后5/6为巩膜,两者交界处有一移行区域为角巩膜缘;血管膜是眼球壁的中间层,由疏松结缔组织、丰富的血管和色素细胞组成,自前向后分为虹膜、睫状体和脉络膜;视网膜是眼球壁的最内层,呈典型10层结构。树鼩眼球组织学结构组成与恒河猴眼球及人类眼球组成一致,组织各层占比大致相同,不同之处是树鼩巩膜上皮含有黑色素细胞,视网膜各层组织占比与人类不同。结论树鼩眼球组织结构与非人灵长类或人类类似,组织形态大致相同,具备用于建立人类眼科相关疾病动物模型的潜力,以阐明相应眼科疾病致病机制。

树鼩脑微血管内皮永生化细胞系的建立及最适D-半乳糖浓度诱导BMECs衰老细胞模型的探讨

目的建立树鼩永生化脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs),明确D-半乳糖对BMECs衰老的影响,探索其潜在机制。方法用携带SV40T基因的慢病毒转染BMECs,传至50代后进行形态观察、生长曲线测定以及免疫荧光和核型鉴定;再用不同浓度D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导BMECs,通过细胞增殖实验确定最适诱导条件,用衰老相关β半乳糖苷酶染色分析细胞衰老情况,Western Blot检测衰老相关蛋白p53的表达水平,超氧化物歧化酶和脂质氧化检测试剂盒检测细胞内氧化应激水平。结果永生化的细胞生长状态较好,不同代次的细胞形态一致,单个细胞呈短梭形或多角形,整体呈典型的铺路石状;细胞生长曲线显示细胞数量在第2~5天时处于对数生长期,在第6天时达到高峰,之后缓慢增长进入平台期;免疫荧光显示该细胞特异蛋白vWF和CD31及永生化基因SV40T为阳性;细胞核型结果显示永生化细胞染色体数目与滇西亚种树鼩的染色体数量相符;D-gal诱导BMECs抑制细胞增殖,有时间和浓度依赖性;实验组,即浓度为10 g/L的D-gal诱导48 h的BMECs,β-半乳糖苷酶染色阳性明显增多、衰老相关蛋白p53显著增多、细胞内SOD酶活性降低和MDA含量增多。结论成功构建树鼩永生化脑微血管内皮细胞系,10 g/L的D-gal是建立永生化BMECs衰老模型的适合浓度,D-gal在体外促进细胞衰老可能是通过促进氧化应激水平、抑制细胞增殖来实现的。

甲型流感病毒对人与实验动物神经系统影响的研究进展

流感作为一种高度传染性疾病,主要影响呼吸系统,常导致肺部并发症,但它也会导致多种罕见却严重的神经系统并发症,包括格林-巴利综合征、横贯性脊髓炎、脑膜脑炎等。近年来,多个国家和地区相继报告了甲型流感病毒引起的神经系统并发症病例,逐渐引起国际关注。然而该并发症的发病机制尚不清楚,相关病例及动物实验科学研究较少,无特定疗法。本文围绕人与实验动物感染甲型流感病毒后神经系统并发症的研究进展进行归纳总结,以期对甲型流感病毒引起的神经系统性疾病有一个全面的认识和理解。

浅谈如何培养高中生学习生物的兴趣

在高中的生物课程理念下,我学会了通过观察生活中的细微现象以及人、动物与自然的不断演变,进而引出相关的生物知识并进行理解和拓展。通过这一阶段对生物知识的活学活用,我能够巧妙地运用生物课程中的理论知识来对我身边一些动物产生的变化进行道理论证。在有限的生物圈里看到了无限的生物魅力,生物这一科目从里到外的开拓了我对大自然生物的了解,提高了我的生活兴趣以及学习兴趣,为我在以后理学的道路上奠定了良好的基础。本文通过笔者在高中阶段生物课程的学习生涯,针对如何培养高中生学习生物的兴趣这一问题给予了自身的见解以及相关办法。