苦参碱对牛源无乳链球菌的体外抑菌活性分析

旨在探讨苦参碱对牛源无乳链球菌的体外抑菌活性及其对无乳链球菌毒力因子的影响,为中药单体抑菌产品的开发与应用提供理论依据。通过测定最小抑菌浓度和抑菌曲线分析苦参碱对无乳链球菌的抑菌活性;同时利用全血杀伤试验、黏附试验、生物膜染色和透射电镜观察等方法,探究苦参碱对无乳链球菌抵御机体杀伤、对宿主的黏附和生物膜形成的影响。结果显示,苦参碱在体外能够有效地抑制无乳链球菌(ATCC13813)的增殖,其对无乳链球菌的最小抑菌浓度为4 mg·mL^(-1),苦参碱可显著降低无乳链球菌生物膜的形成;透射电镜可见无乳链球菌的细胞膜表面皱缩,胞壁光滑变薄,生物膜的形成受到明显抑制。苦参碱可显著抑制无乳链球菌对于乳腺上皮细胞的黏附。荧光定量PCR结果表明,苦参碱可显著降低与侵袭和免疫逃避相关毒力基因ScpB、CpsA、CylE和CAMP的表达(P<0.05),显著上调CpsE基因的表达(P<0.05)。此外,苦参碱可显著降低与毒力因子黏附作用相关的Bac、Bca、Lmb、BIBA、PI-2b和FbsB基因的表达(P<0.05)。以上结果表明,苦参碱在体外能够有效抑制无乳链球菌(ATCC13813)的增殖,破坏细胞的完整性,降低菌株的侵袭力,从而达到抗菌的效果。

体外法研究竹叶黄酮对奶牛乳腺上皮细胞抗氧化及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路中关键基因表达的影响

本试验旨在通过体外法研究竹叶黄酮(BLF)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)抗氧化及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路中关键基因表达的影响。采用单因素试验设计,对照组不添加BLF,试验组分别添加不同浓度(0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、60.0、100.0μg/mL)BLF,处理BMECs 3、6、12、24和48 h后,应用细胞增殖试剂盒(CCK-8)法检测BMECs的活性,应用乳酸脱氢酶(LDH)法检测BLF对BMECs的毒性,每次试验平行复孔6个,重复试验3次。分别应用流式细胞仪和试剂盒法检测BLF对BMECs抗氧化指标的影响,并应用实时荧光定量PCR法检测凋亡相关基因以及mTOR信号通路中相关基因表达量的变化。结果表明:1)BLF对BMECs活性适宜作用浓度为1.0、5.0、10.0μg/mL,最佳作用时间为12 h,且此浓度的BLF对BMECs无毒性作用。2)流式细胞仪检测结果表明,与对照组相比,5.0、10.0μg/mL的BLF极显著降低了BMECs的早期凋亡率和晩期凋亡/坏死率(P<0.01),BLF极显著降低了BMECs的总凋亡率(P<0.01)。3)与对照组相比,5.0μg/mL的BLF极显著降低了细胞内活性氧(ROS)的生成和线粒体膜电位(MMP)水平(P<0.01)。4)与对照组相比,添加BLF可极显著升高BMECs的总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(P<0.01)活性极显著降低丙二醛(MDA)的含量(P<0.01)。5)实时荧光定量PCR的结果表明,与对照组相比,添加5.0μg/mL的BLF显著降低B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)的基因相对表达量(P<0.05);BLF可极显著提高B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)的基因相对表达量(P<0.01),极显著降低Bax/Bcl-2的比值(P<0.01);添加5.0和10.0μg/mL的BLF显著降低环氧合酶-2(COX-2)基因相对表达量(P<0.05),极显著降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)基因相对表达量(P<0.01),极显著提高真核翻译起始因子4E结合蛋白1(EIF-4EBP1)基因相对表达量(P<0.01);此外,与对照组相比,BLF可极显著提高BMECs中mTOR信号通路关键调控基因mTOR、核糖体p70s6(S6K1)和细胞周期素D1(Cyclin D 1)基因相对表达量(P<0.01),极显著提高β-酪蛋白(β-casein)基因相对表达量(P<0.01)。综上所述,BLF可促进BMECs的活性,减少ROS的积累和MMP水平;BLF可显著提高BMECs的抗氧化能力,降低凋亡相关基因的表达,通过mTOR信号通路转导,从而影响乳蛋白的合成。