克氏原螯虾副溶血弧菌的分离鉴定及药敏特性

为了净化水产养殖环境,减少克氏原螯虾(Procambarus clarkii)由于养殖规模不断扩大而感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)导致的大量死亡,寻求安全有效的防治措施,开展了克氏原螯虾副溶血弧菌的分离鉴定及药敏特性试验。2018年5月从湖北省公安县某养殖场采集到一批患病的克氏原螯虾,解剖后发现病虾的肝胰腺肿大发黄,肠道内无食物,有类似肠炎症状,从肝胰腺中分离出的致病菌经TCBS培养,得到光滑蔓延生长的菌落,呈蓝绿色斗笠状,菌落大小不一。显微观察发现细菌形态为棒状或弧状,长短不一,革兰氏染色呈红色,属于革兰氏阴性菌,细菌形态单一;通过分析其16S rDNA序列和生理生化特征,鉴定为副溶血弧菌并命名为Vp-2,其与弧菌属种类同源性最高,并与菌株Vibrio parahaemolyticus DQ068942.1的亲缘关系较近。通过纸片扩散法进行药敏试验,该菌株对氟苯尼考、卡那霉素、复方新诺明等7种抗生素敏感;对利福平、磺胺异恶唑、庆大霉素耐药。生理生化特性测定结果显示,菌株Vp-2的理化特性基本与标准菌株一致。人工回感试验表明,发病克氏原螯虾的症状与自然发病症状类似,解剖发现死亡的克氏原螯虾肝胰腺肿大发黄,肠道内有炎症现象,并从中分离到该菌。分离到的副溶血弧菌菌株对克氏原螯虾有致病性,生产中可用氟苯尼考、四环素等药物进行防治。

克氏原螯虾嗜水气单胞菌噬菌体的分离鉴定和应用

为分离获得致病性嗜水气单胞菌烈性噬菌体,鉴定和研究其生物学特性,为克氏原螯虾细菌性疾病的防治和治疗提供依据,研究以患病克氏原螯虾分离到的致病性嗜水气单胞菌为宿主菌,从湖泊水体中分离到多株噬菌体,对其中一株烈性噬菌体Ph-0进行了生物学特性的分析,包括噬菌斑形态的观察,最佳感染复数的测定,一步生长曲线的绘制,热稳定性的测定等。结果显示,噬菌体Ph-0的噬菌斑呈圆形,边缘可见1 mm左右的半透明晕环;其最佳感染复数为0.1 MOI;一步生长曲线表明其潜伏期约20min,裂解期持续约70min,90min后为平台期;噬菌体在0—40℃下活性无明显变化,但是当温度高于50℃活性开始下降;在pH 3—11的环境中活性良好,具有耐酸耐碱的性质;此外对紫外和氯仿极其敏感,在处理数分钟后滴度下降明显。噬菌体治疗人工感染嗜水气单胞菌的克氏原螯虾试验结果表明,分别采用注射和浸泡两种方法进行治疗,保护率可分别达到66%和20%,病理切片结果显示在使用噬菌体治疗之后,克氏原螯虾的鳃、心脏和肝胰腺均得到不同效果的治疗,总体效果良好。上述研究结果表明噬菌体Ph-0是一株裂解性较强,裂解周期短的烈性噬菌体,对感染嗜水气单胞菌的克氏原螯虾有一定的保护效果。

克氏原螯虾一种新型甲壳素基因的鉴定和抑菌功能研究

抗菌肽是无脊椎动物非特异性免疫系统中重要的免疫因子,抗菌肽具有良好且广谱的抗菌活性,并且不易产生耐药性,有望替代传统抗生素药物发挥功能。甲壳素(Crustin)是目前甲壳类动物中研究比较广泛的一类抗菌肽家族。研究鉴定了来自克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中的一种新型Crustin基因,命名为Pc-CruL。通过Pc-CruL抵抗病原性细菌的免疫防御反应的初步探究,发现Pc-CruL对克氏原螯虾的天然免疫系统至关重要,为深入研究克氏原螯虾奠定了一定的基础,在克氏原螯虾的人工养殖过程中的疾病的预防和治疗中具有一定的指导意义且提供了一定的理论基础。Pc-CruL包含330 bp,编码109个氨基酸,与已知的克氏原螯虾甲壳素同源性较低,为Ⅰ型甲壳素蛋白家族新成员。Pc-CruL在健康的克氏原螯虾的血淋巴、鳃、肠道、胃、心和肝胰腺中均存在,在血淋巴中的含量最高,而在肝胰腺中含量最低。同时进行了体外抑菌实验,结果表明Pc-CruL重组蛋白显著地抑制了几种常见的病原性细菌的生长,具有良好的广谱抑菌活性。体内实验表明,对健康的克氏原螯虾注射Pc-CruL重组蛋白可以保护克氏原螯虾,在副溶血弧菌感染后,提高存活率。Pc-CruL是克氏原螯虾中关键的免疫因子,在克氏原螯虾抵抗外界病原菌入侵和感染过程中起着重要的作用。

斑马鱼ftr56基因克隆表达及功能研究

为进一步了解硬骨鱼类特有的finTRIM(Fish novel tripartite motif,ftr)在斑马鱼(Danio rerio)抗病毒天然免疫中的作用,研究克隆了斑马鱼ftr56基因并分析了其对鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)增殖的抑制作用。根据NCBI中斑马鱼ftr56序列设计引物,采用PCR方法,扩增ftr56 CDS区,连接至真核表达载体pcDNA4.0-His,构建真核表达质粒pcDNA4.0-ftr56-His,进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测SVCV感染斑马鱼胚胎成纤维细胞(ZF4)后ftr56 mRNA的变化。系统进化树分析显示,斑马鱼FTR56单独聚为一支。氨基酸多序列比对结果显示,其与黑猩猩、牛、鼠的TRIM56相似度为22%—23%。FTR56二级结构具有1个RING指结构域,1个B-box结构域,1个卷曲螺旋结构域和1个B30.0结构域。qRT-PCR检测结果显示,ftr56在SVCV感染后24h表达量显著上升。在过表达ftr56后,SVCV的G蛋白mRNA水平和蛋白水平在12h和24h相比对照组明显减少,培养基上清中SVCV滴度也明显降低,表明FTR56抑制SVCV的增殖。实验为进一步揭示finTRIM在鱼类病毒性疾病中的免疫调节机制提供参考。