急性髓系白血病中CD64表达的敏感性及特异性研究

研究急性髓系白血病(AML)免疫分型中CD64的敏感性和特异性。用系列抗原对132例AML患者的骨髓细胞进行直接标记,并用流式细胞术进行分析。结果表明:在AML中,CD64对急性粒-单细胞白血病(M4)和急性单核细胞白血病(M5)中敏感性最高(分别为96.4%和100%),在其他AML(M0、M1、M2、M3、M6、M7)中表达均较低。CD64对M4和M5中的特异性为56.5%。因此,CD64有助于AML中M4、M5的鉴别诊断。

低浓度二甲基亚砜冻存外周血造血干细胞的效果

目的:观察外周血造血干细胞(PBSC)用低浓度二甲基亚砜(DMSO)和羟乙基淀粉(HES)在-80℃条件下冷冻保存的效果。方法:49例次患者的PBSC在冻存后3、6个月及1年进行复苏,分别取样进行有核细胞(NC)计数、锥虫蓝拒染率测定、CD34+细胞阳性率分析和粒-巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)检测。结果:PB-SC在-80℃冰箱中冻存3个月和6个月的NC、CD34+细胞、CFU-GM回收率的差异均无统计学意义(均P>0.05),NC活细胞比率差异也无统计学意义(P>0.05)。PBSC冻存1年NC、CD34+细胞、CFU-GM集落回收率及活细胞比率均有显著性下降(均P<0.01)。结论:应用低浓度DMSO在-80℃冻存PBSC3个月和6个月的细胞能得到较好保存,1年后的冻存效果显著下降。

rhG-C SF动员对外周血淋巴细胞亚群和CD34^+细胞的影响

目的:动态观察自体外周血造血干细胞移植患者经rhG-CSF动员过程中外周血及外周血造血干细胞(PBPC)中淋巴细胞亚群和CD34+细胞的变化,指导临床选择最佳采集时机。方法:对大剂量化疗(HDC)联合重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员的38例白血病和淋巴瘤患者,采用流式细胞术(FACS)测定其动员前后外周血及PBPC中的淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8、NK、CD19和造血干细胞CD34细胞含量的变化,同时用甲基纤维素半固体培养基进行CFU-GM培养来评价干细胞克隆生成能力。结果:动员后外周血淋巴细胞亚群CD3、CD4细胞含量均低于动员前(P<0.01),而动员后外周血中的CD34细胞含量明显高于动员前(P(0.05)。动员后第5天CD34含量达到最高峰。PBPC中CD4、CD4/CD8明显低于外周血(P<0.005),其他淋巴细胞亚群含量与外周血比较无明显变化。动员后外周血中CD34+细胞明显高于动员后,动员后PBPC中CFU-GM生成明显高于外周血(P<0.05),CD4/CD8比值严重倒置,B细胞恢复较快。结论:大剂量化疗联合rhG-CSF动员会使外周血淋巴细胞亚群发生不同程度的变化并明显增加外周血造血干细胞含量。

人动员外周血成体干/祖细胞定向诱导分化为血管内皮前体细胞的免疫表型分析

观察动员后的人外周血成体干/祖细胞体外定向诱导分化为血管内皮前体细胞(EPC)的免疫表型特征及变化。采用健康成人经粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员后的外周血成体干/祖细胞,经贴壁培养法定向分化为EPC,之后通过流式细胞术检测EPC表型。结果显示,培养后的贴壁细胞具有内皮细胞特征,能够与I型荆豆凝集素(UEA-I)结合。流式细胞术检测UEA-I结合率为92.1%,内皮细胞标志物CD31、KDR、CD62E均有不同程度增加,而粒-巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)及CD34表达明显减低,表明诱导分化后细胞的免疫表型发生了相应的变化。

异基因外周血干细胞移植供者动员后淋巴细胞及造血干细胞的变化

目的:观察异基因外周血干细胞移植供者动员前后淋巴细胞亚群及造血干细胞的变化。方法:粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员外周血,直接免疫荧光法标记淋巴细胞和CD34细胞,用流式细胞仪检测其表达情况,甲基纤维素半固体培养基进行CFU-GM培养评价干细胞克隆生成能力。结果:rhG-CSF动员后淋巴细胞亚群与动员前相比无明显变化,CD34+细胞由动员前的0.12±0.08增加到0.83±0.26,CFU-GM有动员前的12±6增加到102±16。结论:正常供者外周血动员后CD34+细胞明显增加,淋巴细胞无明显变化。

CD16+56在急性髓系白血病中的表达及其意义

为探讨CD16+56抗原在急性髓系白血病(AML)中的表达及其临床意义,本文用流式细胞仪检测42例AML患者的骨髓细胞,分析其细胞形态学(FAB)分型、免疫表型和临床特点。结果显示:42例AML患者中CD16+56阳性7例(16.6%),1例部分表达(2.4%),34例没有表达(80.9%)。CD16+56阳性的AML患者中,FAB分型、免疫表型和临床表现各有特点,多见于M2、M5,髓外浸润常见,大多数预后不良。

细胞因子激活骨髓免疫细胞的实验研究

目的 :通过对骨髓单个核细胞在体外与不同细胞因子培养 ,了解不同细胞因子对骨髓淋巴细胞的激活能力和对骨髓干祖细胞的损伤情况。方法 :将IL 1、IL 2、Υ IFN、CD3单抗进行不同组合后 ,在体外与骨髓单个核细胞分成对照组、IL 2组、CD3 AK、CIK组进行培养。培养过程中观察细胞形态和数量的变化 ,并在培养后检测免疫活性细胞的细胞毒性和造血干细胞的保存情况。结果 :培养过程中对照组细胞数量减少 ;IL 2组细胞数量变化不明显 ;CD3 AK组、CIK组细胞数量显著增多 ,并出现较多的集聚成簇的淋巴样细胞 ,培养后其细胞毒性明显强于对照组及IL 2组 ,但细胞数量增加和细胞毒性无明性差异。培养后各组造血干细胞保存情况约 6 0 %～ 87%。结论 :IL 2、CD3单抗在体外与骨髓单个核细胞培养后 ,即能激活免疫细胞增殖 。

RACE技术在钓取白血病相关基因LRP16全长cDNA中的应用

LRP16是我们应用甲基化敏感的限制性界标基因组扫描 (restrictionlandmarkgenomicscanning ,RLGS)技术时发现的一个与白血病复发相关的新基因。为钓取这一新基因的全长cDNA ,本实验采用了cDNA末端快速扩增法 (rapidamplificationofcDNAend ,RACE)。通过对RACE法若干步骤进行优化 ,克隆得到了LRP16基因cDNA的 5′ 与 3′ 非翻译区 ,进而获得其全长及完整的开放阅读框架 ,并作为新基因被GenBank收录。上述结果表明 ,RACE技术是钓取未知基因全长cDNA敏感而快速的方法 ,尤其是对 5′ 及 3′

细胞因子联合激活人骨髓和外周血免疫细胞的比较研究

在本研究中比较了某些细胞因子在体外联合激活骨髓和外周血免疫细胞后二者免疫细胞数量、形态、细胞化学染色、免疫表型和细胞毒变化的差异。在体外加入IFN γ ,rIL 1,rIL 2和McAb CD3分别激活培养骨髓和外周血单个核细胞 ,培养过程中观察两组免疫细胞增殖数量及形态的变化 ,培养前后两组取样进行细胞化学染色和免疫表型检测 ,用MTT法检测培养后两组的细胞毒情况。研究结果发现 ,两组的细胞数量在激活培养后均较培养前明显增加 ,但外周血组增加倍数更多 (P <0 .0 5 ) ;细胞化学染色可见两组培养以后髓过氧化物酶积分均较培养前减少 ,过碘酸雪夫染色见两组含较多粗颗粒的淋巴样细胞明显较培养前多 ;两组CD3+,CD5 6 +和CD38+细胞较培养前明显增加 (P <0 .0 5 ) ,但两组增殖无明显差别 ;骨髓组培养后CD3+CD5 6 +细胞无明显增加 ,而外周血组培养后则增加显著 (P <0 .0 5 ) ;两组激活培养后细胞的细胞毒无明显差异。结论 :IFN γ ,rIL 1,rIL 2和CD3单抗联合激活骨髓和外周血单个核细胞可使二者细胞数量和细胞毒明显增加 ,在临床上可利用激活的不同来源的细胞因子诱导的杀伤细胞进行细胞免疫治疗。

流式细胞仪BrdU/DNA双参数分析法测定急性白血病细胞周期及其临床意义

研究白血病细胞的增殖动力学,探讨其与临床的关系。采用流式细胞仪（FCM）BrdU/DNA双参数分析法测定39例急性白血病骨髓细胞周期的各时相细胞比例及S期细胞的时限（Ts）,其中ANLL26例,ALL13例;初治31例,复发8例（ANLL、ALL各4例）。结果显示,急性白血病骨髓细胞S期比例显著低于正常,初治及复发白血病患者骨髓S期细胞比例之间相差不显著;复发白血病患者骨髓细胞的Ts比初治白血病患者及正常骨髓细胞的Ts都短。提示白血病细胞处于较正常低增殖状态;Ts时限短提示白血病细胞再生迅速,与急性白血病复发关系密切;Ts时限短为白血病预后不良因素之一。

急性移植物抗宿主病病人血清IL-2、IL-8、IL-10及TNF-α水平变化的研究

为了探讨细胞因子IL-2、TNF-α、IL-10、IL-8在异基因造血干细胞移植后aGVHD发病中的作用,观察33例Allo-HSCT患者aGVHD的发病情况。aGVHD的诊断主要依据临床表现,部分病例还依据皮肤、肠粘膜活检的病理学变化。移植前后定期采集患者血清,采用放射免疫法检测细胞因子IL-2、TNF-α、IL-10、IL-8的浓度的变化。结果发现,异基因造血干细胞移植后33例患者均获得造血功能重建,13例发生aGVHD,其中8例Ⅰ度aGVHD,5例Ⅱ-Ⅳ度aGVHD。IL-2、TNF-α水平在aGVHD阳性组明显高于aGVHD阴性组,而IL-10的水平在aGVHD阳性组明显低于aGVHD阴性组,IL-8水平的变化无统计学意义。结论细胞因子IL-2、TNF-α在临床aGVHD的发病中起重要的正向调节作用,定期检测患者血清的IL-2、TNF-α水平有助于预测aGVHD的发生。

新的白血病复发相关候选基因LRP15全长cDNA的克隆

为了克隆与白血病复发相关的新基因 (LRP15 )的全长cDNA序列 ,应用分子生物学及生物信息学技术对一段已知仅在白血病复发标本中被甲基化的 1.8kb长的DNA片段进行研究分析 ,通过美国生物信息中心 (NCBI)提供的hEST数据库进行电子杂交 ,并对获得的相互重叠的EST片段进行组装 ,设计引物进行cDNA末端快速扩增(RACE)。以高通量基因组序列 (HTGS)数据库及SAGE文库为基础 ,将获得的cDNA片段进行染色体定位及组织表达分析。结果表明 ,LRP15基因的cDNA序列全长 1718bp ,含 1个 780bp的开放读码框架 ,编码 2 5 9个氨基酸。该基因定位于染色体 3p2 4 ,在多种组织中表达。结论 :RACE技术是克隆新基因的有效方法 。

STR-PCR分析嵌合体在同种异基因造血干细胞移植中的应用

利用荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列(STR-PCR)结合毛细管电泳检测供者细胞嵌合率(DC),以探讨该方法的连续检测对异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后转归的预警作用,采集27例清髓性外周血干细胞移植患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓,DNA样本用Profiler Plus和Cofiler Plus商品化试剂盒扩增后,用ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果表明:两种试剂盒测得的DC嵌合率一致;在27对中能区别出供受差别的STR位点,Profiler Plus为6.3(4-9)个,Cofiler Plus为4.9(2-6)个。26例患者均在移植后28天出现供者细胞,1例患者未出现供者细胞。14例患者DC100%,均获得持久植入,至今仍无白血病生存;另有9例患者出现不稳定混合嵌合(MC)状态(DC为0%-90.2%),其中5例为血液学复发。27例病人中有6例死亡。上述5例复发患者均在出现临床症状前发生DC量下降;供者细胞完全嵌合组移植物抗宿主病(GVHD)的发生率高于MC组。结论:动态检测DC可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD的发生均有预警作用,对早期实施临床干预治疗有重要的指导意义。

一种简便的外周血干细胞冷冻保存法

为了简化传统的细胞冷冻方法 ,即用 10 %二甲基亚砜 (DMSO)作为冷冻保护剂并用程控降温仪 - 196℃液氮保存 ,研究了用 5 %DMSO ,3%羟乙基淀粉 (HES)和 4 %人血白蛋白 (HSA)作为冷冻保护剂 ,而不用程控降温仪直接 - 80℃冰箱冷冻细胞的方法。对比了不同方法冷冻保存外周血干细胞 (PBSCs)的细胞活性、单个核细胞数、CFU GM和CD34+ 细胞回收率。结果发现 ,简便冷冻法可获得更高的单个核细胞 (MNC)和CFU GM回收率 ,无凝集现象 ;并且经长达 2 4个月冷冻保存后仍可获得满意的CFU GM和CD34+ 细胞回收率。 37℃融冻和 2 0℃室温融冻法之间各项指标无明显差别 ,细胞融冻后在室温下暴露于 5 %DMSO中 1小时 ,CFU GM回收率并不降低 ,而细胞活性从 93.2 %降至 84 .5 %。所以 ,这种简便的细胞冷冻保存法简便易行 ,可替代传统的液氮保存法 ,对于没有程控降温仪的单位具有实用价值 ,而且还可减少病人DMSO输入量和毒性。

重组人白介素11联合粒细胞集落刺激因子动员的自体外周血造血干细胞移植

本研究旨在探索重组人白介素11(rhIL-11)联合重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员外周血造血干细胞进行自体外周血干细胞移植的作用。16例预行自体外周血干细胞移植的非霍奇金淋巴瘤及急性髓系白血病患者随机分为实验组(rhIL-11联合rhG-CSF动员)及对照组(rhG-CSF动员),两组均在动员性化疗后血象下降至最低值有回升迹象时应用rhIL-11及rhG-CSF;rhG-CSF5μg/(kg·d)动员中位时间5.5天,rhIL-1150μg/(kg·d)动员中位时间4天;动员后观察外周血白细胞和血小板计数,以及干细胞采集物单个核细胞、CD34+细胞、CFU-GM集落数的变化;按常规进行自体外周血干细胞移植后,观察粒细胞及血小板植活时间及单采血小板输注量。结果显示:实验组及对照组动员后外周血白细胞和血小板计数,以及干细胞采集物单个核细胞、CD34+细胞及CFU-GM集落数无显著性差异(p>0.05)。自体外周血干细胞移植后,实验组中性粒细胞数≥0.5×109/L的中位时间为10.5天,对照组中为13天,实验组比对照组提前2.5天(p<0.05)。实验组血小板数≥20×109/L的中位时间为11.5天,对照组为13天,实验组比对照组提前1.5天(p<0.05)。实验组输注单采血小板中位数为3.5单位,对照组为5单位,实验组比对照组减少1.5单位(p<0.05)。实验组使用动员剂的不良反应主要有低热、乏力、感冒样症状、食欲不振、头晕、肌肉酸痛等,对照组仅出现低热,患者对以上症状均可以耐受,停药后症状自行消失。结论:rhIL-11联合rhG-CSF动员外周血造血干细胞安全有效,在自体外周血干细胞移植后造血重建较快,单采血小板输注量少。

急性白血病细胞IGSF4基因启动子甲基化的研究

为了研究白血病细胞IGSF4基因启动子是否存在甲基化 ,采用RT PCR检测IGSF4在U937,Molt4和HL 6 0细胞的表达 ,用MS PCR检测上述白血病细胞系及 2 1例白血病患者IGSF4基因甲基化情况 ,用 5 杂氮胞苷对白血病细胞系进行去甲基化处理。结果表明 :IGSF4启动子在正常骨髓无甲基化 ,在U937,Molt4和HL 6 0细胞IGSF4基因由于启动子甲基化而不能表达 ,上述细胞系经去甲基化处理后均可恢复表达IGSF4。 5 7.1%的急性白血病患者的细胞存在IGSF4启动子甲基化 ,甲基化发生率在急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病无差异。结论 :正常IGSF4作为一个抑癌基因可能在阻抑白血病的发生发展中起重要作用 ,IGSF4基因甲基化可能成为监测白血病复发的指标。

中剂量rhG-CSF对正常供者外周血CD34^+细胞动员效果

本研究探讨中等剂量600μg/d粒细胞集落刺激因子(GCSF)对正常供者CD34+细胞的动员效果及动员前后外周血单个核细胞中T细胞亚群的变化。对2002-2004年我科31例健康供者给予rhGCSF600μg/d,在动员的第4天开始采集外周血干细胞(PBSC),并检测动员前后白细胞总数、动员后的有核细胞(NC)数、单个核细胞(MNC)数、CD34+细胞数及粒巨噬细胞集落形成单位(CFUGM),同时观察动员及采集过程中的不良反应。对12例供者GCSF动员前后外周血单个核细胞中T细胞亚群的变化进行了观察。结果显示:600μg/d组与既往使用的300μg/d组相比,rhGCSF动员后的外周血细胞中NC、MNC和CD34+细胞及CFUGM显著增加(P<0.05),受者造血重建时间缩短(P<0.05),动员和采集过程中的不良反应发生率无明显上升(P>0.05),无严重不良反应发生。动员后CD3+细胞在PBMNC中的比例较动员前下降(15.05±3.3)%,(P<0.05)。动员前后CD4+/CD8+淋巴细胞的比值无明显变化(P>0.05)。结论:600μg/d的GCSF对正常供者的动员效果好,受者造血重建快,无严重不良反应发生。动员后PBMNC中CD3+细胞的下降及CD4+/CD8+淋巴细胞比值无明显变化,从而使得移植后急性GVHD的发生率无明显上升。

化疗联合G-CSF动员的骨髓及外周血CD34^+细胞表达粘附分子的变化

探讨化疗联合G CSF动员前、后患者骨髓及外周血CD34+细胞表达CD4 4 ,CD4 9d ,CD6 2L及趋化因子CXCR4的动态变化 ,用免疫荧光直接三色标记和流式细胞术测定G CSF动员前、后骨髓及外周血CD34+细胞的CD4 4 ,CD4 9d ,CD6 2L及趋化因子CXCR4的表达 ,观察输注各表达亚群细胞数与移植后造血重建的关系。结果发现 ,动员后骨髓中CD34+CD4 4 +和CD34+CD4 9d+细胞的百分比较动员前明显降低 ,而外周血中二者的比例则显著升高 ;动员前、后骨髓中CD34+CD6 2L+和CD34+CXCR4 +细胞的变化并不明显 ,而外周血中前者明显增加 ,后者则显著减少。输入CD4 4 +,CD4 9d+,CD6 2L+及CXCR4 +的CD34+细胞的量与移植后血中中性粒细胞和血小板恢复的时间未表明有显著的相关。结论 :G CSF动员可下调骨髓CD34+细胞的CD4 4 ,CD4 9d ,CD6 2L及CXCR4的表达 ,从而进入外周血循环 ,输注这些细胞的临床意义有待累积更多病例的分析。