利用CRISPR技术下调T细胞功能负调节基因PD-1表达的研究

目的：探索慢病毒介导的成簇的规律间隔短回文重复序列（ CRISPR）技术下调原代T细胞PD-1基因的可行性。方法将多个PD-1靶向序列作为sgRNA序列体外合成后,分别插入带有cas9基因的慢病毒载体 pLentiCRISPR 中,包装慢病毒并感染原代 T 细胞,通过流式细胞术分析CRISPR技术敲除对PD-1表达的影响。结果构建了6个靶向基因PD-1不同位点的pLentiCRISPR载体A1-A6,并且包装病毒。发现原代T细胞的激活状态与PD-1的表达相伴随,以及PD-1高表达细胞群中存在CD25共表达现象。含有靶向基因PD-1的CRISPR病毒分别感染T细胞后,A2和A6对PD-1高表达的细胞群敲除效率最好,分别为19%和29%。结论 CRISPR技术可在原代T细胞中有效敲除PD-1。

不同培养基对流式细胞仪分选外周血T细胞的影响

目的:通过探讨用于流式分选的T细胞体外扩增的无血清培养基,提高过继细胞的增殖能力和活性。方法:采用人外周血淋巴细胞分离管制备外周血单个核细胞,再用流式细胞分选仪从6例健康志愿者的外周血单个核细胞中分选CD3;T细胞到4种常用的培养基中:X-VIVO 15、KBM 581、TexMACS GMP和10%FBS/1640,观察并记录培养细胞的状态和体外增殖能力。于第3天,第6天和第8天,通过胎盼蓝染色后进行活细胞计数。于第8天用凋亡试剂盒检测扩增细胞的凋亡情况,并用流式细胞分析仪检测细胞的免疫表型。结果:X-VIVO 15、TexMACS GMP和10%FBS/1640作为流式细胞分选的接收液仅少量细胞碎片,而分选在KBM 581的细胞大量死亡,显著高于X-VIVO 15组(P<0.05)。X-VIVO 15中扩增的细胞数量最多,增殖检测结果显示活细胞在X-VIVO 15中快速增殖且细胞凋亡率显著低于KBM 581和TexMACS GMP(P<0.05)。4种培养基扩增的细胞主要呈现效应记忆型。其中,X-VIVO 15中效应记忆型T细胞比例显著高于TexMACS GMP(P<0.05)。TexMACS中效应细胞比例显著高于10%FBS/1640(P<0.05)。结论:X-VIVO 15无血清培养基扩增流式分选的T细胞具有高增殖能力、细胞活性和记忆表型,适用于经流式分选后细胞的体外扩增。