柽柳再生和转化体系的建立及瞬时转化TcSYP121基因功能分析

【目的】建立柽柳再生及遗传转化体系并分析瞬时转化柳树突触融合蛋白(TcSYP121)基因功能,为筛选柽柳分子抗性育种候选基因及盐碱土的改良和生态修复提供理论参考。【方法】通过单因素筛选最佳外植体、消毒处理、各阶段(初代、分化、增殖和生根)的培养基类型及激素浓度建立柽柳再生体系;通过正交试验分析影响转化体系的4个因素(预培养时间、侵染时间、共培养时间和农杆菌浓度);通过PCR扩增及电泳结果验证柽柳转化体系;瞬时转化TcSYP121基因获得过表达植株(OE)和病毒诱导的基因沉默植株(VI),进行表型观测、植物超氧阴离子染色液(NBT)和二氨基联苯胺法(DAB)染色并测定盐腺直径和盐腺密度、叶绿素含量、超氧化物酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性及TcSYP121基因相对表达量,分析TcSYP121基因的功能。【结果】最优外植体为柽柳嫩茎段,最适宜次氯酸钠(NaClO)消毒浓度为5%,最佳消毒时间为5 min,最适合的初代培养基为MS培养基,最佳分化培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,最佳增殖培养基为MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA,最佳生根培养基是1/2MS+0.5mg/L IBA。转化体系中正交试验结果为最佳预培养时间是2 d,最佳侵染时间是5 min,最佳共培养时间是2 d,最佳农杆菌浓度OD600为0.8,抗生素头孢霉素(Cef)浓度为300 mg/L,卡那霉素(Kan)筛选压为30 mg/L。PCR扩增及电泳结果显示,利用该遗传转化体系可获得阳性转基因植株。瞬时转化TcSYP121基因柽柳的耐盐功能分析结果显示,在盐胁迫下,VI和对照(CK)柽柳中叶绿素含量显著下降(P<0.05),而OE下降不显著(P>0.05);OE柽柳SOD和POD活性均高于VI与CK,且OE中Tc SYP121基因的相对表达量高于CK和VI。【结论】建立了柽柳的再生体系和遗传转化体系,通过对柽柳进行瞬时转化获得过表达和沉默表达柽柳,证实TcSYP121基因能够提高柽柳耐盐性。

结核分枝杆菌抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6和Rv2031c-Rv2626c重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6(AE)和Rv2031c-Rv2626c(R2)的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗的研究奠定基础。方法体外合成人延长因子1α(EF1α)启动子DNA序列,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建含有CMV、EF1α双启动子的腺病毒穿梭载体。PCR扩增课题组前期构建的AE、R2融合蛋白基因,并依次亚克隆至上述腺病毒穿梭载体的CMV和EF1启动子下游,阳性重组穿梭质粒命名为pAd-AE-R2。将pAd-AE-R2与骨架质粒共转染HEK293细胞,包装获得重组腺病毒,命名为Ad-AE-R2。RT-PCR法和间接免疫荧光法(IFA)对重组腺病毒表达的AE、R2融合蛋白的基因和蛋白表达水平进行鉴定。结果Ad-AE-R2瞬时转染的HEK293细胞中可转录表达AE、R2融合蛋白基因。IFA法采用Ag85B、ESAT-6、Rv2626c和Rv2031c 4种抗原的单克隆抗体可分别检测到Ad-AE-R2感染的巨噬细胞中具有特异性的绿色荧光,表明Ad-AE-R2能够在宿主细胞内表达AE、R2融合蛋白。结论成功构建并包装获得表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白AE、R2的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗研究奠定基础。

结核分枝杆菌蛋白重组腺病毒黏膜免疫对小鼠哮喘的免疫预防作用

目的利用表达结核分枝杆菌蛋白Ag85B、ESAT-6、Rv2031c和Rv2626c的重组腺病毒(Ad-AE-R2)滴鼻黏膜免疫小鼠,探究其对哮喘小鼠气道炎症的免疫预防作用。方法本研究为实验研究,采用单纯随机抽样方法。将18只6~8周龄BALB/c雌性小鼠随机分为3组:空白对照组、哮喘模型组和免疫预防组,每组6只。免疫预防组滴鼻免疫108 PFU Ad-AE-R2,空白对照组和哮喘模型组滴鼻等量生理盐水。小鼠免疫3周后,利用卵清蛋白诱导免疫预防组和哮喘模型组小鼠哮喘。空白对照组用生理盐水雾化作为对照。末次激发小鼠哮喘24 h后,麻醉处死各组小鼠,检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和外周血中IgE和γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素5(IL-5)、IL-13等细胞因子的含量,HE染色观察肺组织病理学改变。结果与空白对照组相比,哮喘模型组BALF和血清中的IgE含量增加(均P<0.05),BALF中IFN-γ/IL-5下降(P<0.01)。与哮喘模型组相比,免疫预防组BALF中IL-13含量降低(P<0.01),BALF和血清中IFN-γ/IL-5升高(均P<0.05)。小鼠肺组织病理切片HE染色结果表明,与空白对照组相比,哮喘模型组小鼠肺组织结构出现明显损伤,气道黏膜上皮细胞局部脱落,管壁及基底膜显著增厚,气道及血管周围可见大量炎症细胞浸润;与哮喘模型组相比,免疫预防组小鼠肺组织中的炎症性病理改变明显减轻。结论利用卵清蛋白成功诱导小鼠气道炎症,建立小鼠哮喘模型。Ad-AE-R2黏膜免疫可以提升小鼠气道Th1型免疫反应,促进Th1/Th2型细胞因子平衡,对小鼠哮喘具有一定的预防保护效果,为哮喘的免疫预防提供研究参考。

黑龙江省体育小镇开发的SWOT分析

本文主要运用SWOT分析法、实地调查法等研究方法,对黑龙江省体育小镇的开发进行SWOT分析,分析得出黑龙江省开发体育小镇的优势和劣势,同时分析出黑龙江省体育小镇开发过程中所面临的的机遇和挑战,最后通过SWOT分析提出三点建议,从而促进黑龙江体育小镇更快更好的发展。

黑龙江体育小镇发展现状与对策研究

研究利用文献资料法和实地考察法等方法,对黑龙江体育小镇发展现状与对策进行研究,发现体育小镇存在组织宣传不到位,价值挖掘不充分、专业型人才不足,复合型人才稀缺、小镇定位与消费行为契合度较低的问题,并在此基础上提出黑龙江体育小镇发展的相关对策:以市场化的方式来建设和发展体育小镇,以北京冬奥会为契机扩大影响力,以体育产业高质量发展为目标。