广西莪术SSR-PCR反应体系优化和引物筛选研究

以广西莪术(Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang)嫩叶为材料,采用单因素和正交试验设计建立和优化SSR-PCR反应体系和反应程序,对最适宜退火温度(Tm)进行筛选优化,对17对已公布的姜黄属通用性引物进行扩增试验,筛选出多态性好、条带清晰的引物。结果表明,建立了适合广西莪术SSR分析的反应体系和扩增程序,即在15μL体系中,DNA模板为30 ng/μL,3μL,Mix(包含DNTP、Mg2+、1×buffer、Taq酶)为5μL,dd H2O为6μL,引物为各0.5μL时,分析效果较好,扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性30 s,根据不同引物的退火温度复性30 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;最后72℃延伸5 min;反应结束后,4℃保存。同时筛选出在试验材料中能产生较清晰主带的引物共12对,初步验证了应用SSR分子标记分析在广西莪术遗传多样性的可行性。

广西莪术EST-SSR标记开发

目的利用NCBI公布的姜黄EST序列,挖掘SSR位点,开发近缘种广西莪术EST-SSR标记。方法下载NCBI公布的姜黄EST序列,利用SSR-FINDER搜索SSR位点,采用Primer5.0设计SSR引物,挑选30个表现型差异较大的广西莪术进行有效性及多态性检测。结果 12 678条EST序列含有SSR位点1 243个,其中二核苷酸、三核苷酸重复序列最多,分别占50.36%,31.54%,以AT/TA和CT/GA出现频率最高。利用Primer5.0设计引物共325对,PCR检测表明,104对引物可以扩增出稳定清晰的带型;在至少30份不同种质广西莪术中检测到48对SSR引物具有多态性,占设计引物的38.09%。结论姜黄EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR标记开发效率较高。

广西莪术EST-SSR标记开发及其在遗传多样性分析中的应用

目的:分析姜黄表达序列标签(EST)中简单重复序列(SSR)位点的分布特点,开发近缘种广西莪术EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于进行广西莪术遗传多样性分析及分子育种的可行性。方法:下载NCBI中公布的姜黄EST 12 678条,利用SSR-FINDER搜索SSR位点,筛选符合条件的序列,采用Primer 5.0设计SSR引物,挑选30个表现型差异较大的广西莪术种质进行引物有效性及多态性检测,对50份广西莪术种质进行遗传多样性分析。结果:12 678条EST序列含有SSR位点1 243个,其中二核苷酸出现频率为50.36%,三核苷酸31.54%,四核苷酸10.30%,以AT/TA和CT/GA出现频率最高。利用Primer 5.0设计引物共325对,聚合酶链式反应(PCR)检测表明,104对引物可以扩增出理想PCR产物,在至少30份不同种质广西莪术中检测到48对SSR引物具有多态性,占设计引物的38.09%。遗传多样性分析研究,聚类分析结果表明50份广西莪术种质在相关系数0.7处,聚类为2类,遗传相似性系数变化范围较窄。结论:姜黄EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR标记开发效率较高。本研究开发了48对广西莪术EST-SSR标记,并筛选出富含SSR位点的候选序列,用聚类图验证了植物之间的亲缘关系,为广西莪术遗传多样性分析和分子育种研究提供参考。