猪呼吸道病相关的常见病毒PCR/RT-PCR检测方法的建立

为建立猪呼吸道病相关的几种病毒PCR/RT-PCR检测方法,根据GenBank登录的猪伪狂犬病病毒(PRV,gB,AF257079)、猪圆环病毒2型(PCV-2,ORF2,NC-005148)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV,ORF6,NC-001961)、猪瘟病毒(CSFV,C,AY805221)、猪细小病毒(PPV,NS1,NC-001718)和猪流感病毒(SIV,M,GU086140)6种常见病毒的相关保守基因序列分别设计一对特异性引物,通过对其条件的优化,建立了检测以上6种病毒的PCR/RT-PCR诊断方法,扩增的目的片段长度分别为192bp(PRV)、255bp(PCV-2)、364bp(PRRSV)、530bp(CSFV)、759bp(PPV)和981bp(SIV)。通过试验证明该检测方法具有良好的特异性和敏感性,对该6种病毒的核酸检测最小量依次为2.5×10-3ng、2.2×10-4ng、3.2×10-3ng、8.3×10-3ng、3.7×10-3ng和3.7×10-3ng,为检测以上6种病毒提供了参考。

猪伪狂犬病病毒主要基因变异及与gE/gB基因有关的净化方法研究

伪狂犬病被国际动物卫生组织(OIE)列为二类传染病,国内外近几年由于伪狂犬病流行正呈上升趋势,以及造成的巨大经济损失,许多国家己经将伪狂犬病列为了重点防疫并计划最终根除的猪病之一。随着分子生物学发展,人们对伪狂犬病病毒的基因结构、基因功能、检测手段以及疫苗预防方法有了更深入的认识。文章就猪伪狂犬病毒基因的结构特点、功能和主要基因变异的研究等方面进行了综述,以期对我国伪狂犬病毒基因及其基因变异的研究提供一定依据,同时结合本实验室对伪狂犬病gE/gB基因建立的多重PCR净化的病原学研究和国家对该病采用gE/gB-ELISA检测血清学净化方法标准进行了综合,为制定猪伪狂犬病防治及净化提供理论参考。

细胞因子IL-2和IL-4对病毒保护性抗原基因真核表达影响的研究

如何提高和改善疫苗的免疫效果是目前疫苗研究的热点,近年来许多研究发现与DNA疫苗联合应用的细胞因子可通过不同的环节调节和增强DNA疫苗免疫效应,白细胞介素作为免疫佐剂能协同DNA疫苗能取得较好的免疫效果。细胞因子是动物体内特异高效调控免疫细胞和协调免疫应答重要的信号分子,它主要包括淋巴毒素(LT)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(INF)、白细胞介素(IL,如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12)和集落刺激因子(GM-CSF)等。其中IL-2和IL-4对病毒保护性抗原基因真核表达影响的研究较多。主要综述了IL-2和IL-4作为免疫佐剂对病毒保护性抗原基因真核表达的影响,以期为更深入地进行IL-2和IL-4对DNA疫苗免疫增强作用的深入研究提供参考。

中西医结合治疗猪乳房炎

2015年1月，贵州贵阳花溪某猪场有一头母猪出现食欲减退、乳房红肿、触摸有硬块、疼痛拒按、拒绝给仔猪哺乳；乳汁变质（稀薄）、有脓血现象；仔猪出现黄、白痢。对该发病母猪进行临床症状观察，诊断该发病母猪的疾病为猪乳房炎，现将诊疗结果报告如下：1 临床症状 该规摸化猪场发病母猪体温升高至41℃，食欲减退，乳房红肿，触摸有硬块，乳汁稀薄，含有絮状物；

猪瘟病毒E0和E2基因变异及猪瘟净化方法的研究

猪瘟是危害养猪业的烈性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为16种A类法定动物传染病之一。随着分子生物学研究的不断发展,人们对猪瘟病毒的基因结构、基因功能、检测手段、野毒和疫苗毒的鉴别以及疫苗预防方法有了更深入的认识。文章就猪瘟基因的结构特点、E0和E2基因的功能和变异的研究等方面进行了综述,以期对我国猪瘟病毒基因及其基因变异的研究提供一定依据,同时结合本实验室建立的对猪瘟病毒野毒和疫苗毒建立的二重PCR鉴别诊断和猪瘟净化方案的研究进行了综述,以期为猪瘟防治及净化方案的制定提供一定的参考。

猪圆环病毒Ⅱ型贵州分离株ORF2基因表达的试验

通过采集疑似猪圆环病毒感染的病料,分离到1株猪圆环病毒2型贵州株,并对其进行了鉴定。原核表达试验结果表明,PCV-2贵州株的ORF2基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达的目的蛋白约为40.0 k Da,且复性蛋白具有一定免疫原性。将真核表达质粒分别转染PK-15细胞,以掌握ORF2基因和白细胞介素-2(IL-2)基因体外表达情况;将重组质粒、空载体及生理盐水分别免疫BALB/c小鼠,以监测血清中特异性抗体及T淋巴细胞亚群含量,从而探讨猪圆环病毒Ⅱ型贵州分离株ORF2基因真核表达效果及长白猪细胞因子IL-2对PCV2 ORF2免疫原性的影响,结果表明,pc DNA3.1-ORF2和pc DNA3.1-ORF2-IL-2在PK-15细胞中获得了较高的表达,IL-2可明显增强PCV-2 DNA免疫效果。

猪瘟病毒E0和E2基因变异及猪瘟净化方法的研究

（上接2016年第6期106页） 近年来，猪病毒性疾病已严重危害世界规模化养猪业，我国许多规模化猪场均不同程度受威胁，疾病的发生和流行日益严重，发病率越来越高，猪群发生疾病时多种病原混合感染和继发感染的情况越来越普遍，

某猪场4种猪病毒性疫病抗体水平检测及分析

为了解贵州省某规模化猪场4种猪常见病毒性疫病的抗体水平及感染情况,实验采用ELISA抗体检测法,对该猪场送检的370份血清进行了CSFV、PRRSV、PCV2和PRV 4种抗体水平检测。实验结果表明:该猪场种猪CSFV、PRRSV、PCV2和PRV抗体阳性率分别为100%、94.74%、100%、5.26%,保育猪CSFV、PRRSV、PCV2和PRV抗体阳性率分别为94.44%、83.33%、16.7%、5.56%;其中种猪CSF、PRRS、PCV2、PR已接种疫苗;保育猪CSF、PRRS、PR已接种疫苗,未接种PCV2疫苗,上述数据说明该猪场种猪CSF、PCV2、PRRS、PR免疫效果较好;保育猪CSF、PRRS、PR免疫效果较好,PCV2有野毒感染现象。该猪场种猪应在保育猪阶段做好PCV2的预防接种工作,同时做好猪场的疫病净化措施。

猪瘟和猪伪狂犬野毒与其疫苗株多重PCR鉴别方法的建立

为建立一步法鉴别检测猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与其疫苗株感染的多重PCR方法(m PCR),本实验通过比对分析Gen Bank中登录的CSFV和PRV的相关基因序列分别设计可以区分CSFV与PRV及其疫苗株的5对特异性引物,建立了其多重PCR鉴别检测方法。结果表明,建立的多重PCR方法对CSFV和PRV扩增为阳性,而对PCV2、PRRSV、JEV和BVDV扩增结果均为阴性;最低核酸检测量分别为1.7×10~3拷贝/μL(CSFV野毒株)、9.9×10~3拷贝/μL(CSFV-C疫苗株)、1.3×10~3拷贝/μL Guizhou-DY)、6.9×10~3拷贝/μL(Bartha-K61)和5.5×10~3拷贝/μL(SA215)。采用该方法对134份可疑临床样品进行检测,结果表明CSFV和PRV疫苗株与野毒株在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的5重感染率分别为2.6%(1/38)、7.7%(2/26)、8.3%(3/36)和8.8%(3/34)。本研究建立的多重PCR方法为从病原学方面快速鉴别CSF和PR疫苗毒与野毒提供了新的技术支撑,为规模化猪场实现猪瘟与猪伪狂犬的净化提供一种新方法。

鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的单一与二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)临床样本快速、简便的检测技术,以区分猪瘟(classical swine fever,CSF)野毒和疫苗毒感染,为规模化猪场CSF净化奠定基础。通过对GenBank中CSF野毒、疫苗毒及近源病毒的基因组全序列比对,发现CSF兔化弱毒疫苗株3′-NTR独立存在富含T的插入序列,根据这一特点分别在该插入序列的上、下两端设计2对单一RT-PCR引物并选择特异保守区域设计了二重RT-PCR引物,优化筛选能够鉴别CSF野毒与兔化弱毒疫苗的PCR反应条件,建立了能鉴别CSF野毒和疫苗毒的单一与二重RT-PCR鉴别诊断方法。敏感性和特异性分析表明,单一RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为2.2pg(单一RT-PCR中的1对引物)和1.7pg(单一RT-PCR中的另外1对引物);二重RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为8.2pg(CSF野毒)和6.7pg(CSF疫苗毒),两种方法均检测不到PRV、PRRSV、JEV、BVDV、PCV2的DNA/RNA。采用该方法对146份可疑临床样品进行检测,结果表明CSF疫苗毒与野毒在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的二重感染率分别为6.3%、7.4%、8.3%、8.6%。本研究建立的单一与二重RT-PCR方法都具有敏感性强、特异性优、重复性好的特点,该研究对规模化猪场猪瘟的净化具有十分重要的参考价值。

日本乙型脑炎病毒强、弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-NS2A诱导小鼠CD4^+T细胞应答的研究

为了解日本乙型脑炎病毒(JEV)强、弱毒株非结构蛋白的免疫效果,笔者分析了JEV强、弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A真核表达的差异。通过观察JE减毒活疫苗(SA14-14-2株)和JEV贵州分离株(GZ株)分别在BHK-21细胞上出现的CPE,并收集强、弱毒株的细胞悬液,提取总RNA,分别设计6对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A的编码基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-NS1r、pcDNA3.1(+)-NS2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1q、pcDNA3.1(+)-NS2Aq和pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq,将构建成功的6种真核表达质粒免疫健康小鼠,最后采集小鼠的血液和组织分别进行JEV抗体检测和细胞免疫水平检测。研究结果显示:JEV GZ强毒株与JEV SA14-14-2弱毒株能在BHK21细胞上增殖并产生CPE现象;构建的6种真核表达质粒免疫小鼠后经血常规和T淋巴亚群检测可以极显著或显著增加CD4+和CD8+细胞的含量。表明JEV强毒株非结构蛋白所诱导的细胞免疫略优于弱毒株非结构蛋白诱导的细胞免疫,但差异不明显。本研究结果可为日本乙型脑炎病毒的病原基础研究提供参考。

贵州某动物园羊驼坏死梭杆菌感染的诊治

2016年1月29日,贵州某动物园有羊驼4只,4~5岁,其中3只羊驼出现跛行,检查发现：发病羊驼跖关节部体表皮肤发生化脓、坏死,伴有明显臭味。根据临床症状和实验室诊断,确诊为坏死梭杆菌感染所引起的羊驼皮肤溃疡。诊治结果报告如下。

贵州省某规模化猪场猪瘟、猪伪狂犬病和大肠杆菌病混合感染的诊断（英文）

为了解贵州省某规模化猪场猪只发病原因,课题组成员采用流行病学调查、临床症状观察、病理剖检诊断、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR/RT-PCR检测、细菌分离鉴定等方法对送检的发病猪病料进行诊断。结果表明,该猪场猪只为猪瘟病病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)和大肠杆菌混合感染。建议该猪场根据诊断结果及时做出处理。

猪繁殖与呼吸综合征诊断技术的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征又称猪蓝耳病,是严重危害养猪业的传染病之一,2006年我国自南向北大面积暴发高致病性猪繁殖与呼吸综合征,目前该病在我国有的地区又出现不断发病的事态,在整个防控过程中快速准确的诊断方法与技术对诊断猪繁殖与呼吸综合征至关重要。本文主要从猪繁殖与呼吸综合征的病毒的分离鉴定、血清学诊断方法和分子生物学诊断等方法及技术的新研究进展进行了综述,以期为猪繁殖与呼吸综合征的诊断与防控提供一定的理论支持和参考依据。

猪圆环病毒病2型诊断技术的研究进展

猪圆环病毒(PCV)是迄今为止发现的一种最小的脊椎动物病毒,可引起断奶仔猪进行性消瘦、淋巴组织等组织病变的一种多系统衰竭综合征的重要传染病,临床上主要与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤(CT)、坏死性间质性肺炎(PNP)及母猪繁殖障碍等疾病有关。根据病毒致病性的差异,以及核苷酸序列和抗原性的不同,将猪圆环病毒分成无致病性的猪圆环病毒1型(PCV1)和具有致病性的猪圆环病毒2型(PCV2)。本文从病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断等方面综述了当前国内外PCV2常用的实验室诊断方法的研究进展,可为临床上猪圆环病毒病的确诊提供参考。

猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型及链球菌混合感染的诊断

2016年3月贵州省某规模化猪场的保育猪相继出现四肢无力，趴地不能站立，叫声嘶哑，死亡率高。经临床检查和实验室诊断确诊为猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型和链球菌混合感染。现将诊断结果报道如下。

中西兽医结合治疗摩拉斗牛肺炎和尿路感染

2017年7月下旬,贵州花溪孟关乡某农户家的摩拉斗牛出现喘气、阴茎疼痛、少尿甚至无尿、排尿呈努责姿势等症状。农户将发病牛送到贵州大学动物医院就诊,通过采用中西医结合治疗的疗效较好。诊治情况报告如下。1发病情况贵阳市花溪区孟关乡某农户的摩拉斗牛于2017年7月29日开始发病。

日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的研究

日本乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的严重的人畜共患性传染病,日本乙型脑炎病毒的结构蛋白包括C、Pr M和E 3种。其中C蛋白主要参与病毒RNA和蛋白之间的相互作用,且具有核定位信号序列,在乙脑病毒中,缺失此序列后C蛋白只在感染细胞的细胞质中出现;PrM和E基因是其主要免疫保护性抗原基因,表达的蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白,是病毒颗粒的主要成分,也是维持病毒粒子形态结构的主要物质,主要参与病毒感染的后期阶段,可诱导产生保护性免疫。近年来许多学者对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因原核表达和真核表达及其相关免疫原性进行了大量的研究,取得了一定的研究进展,文章主要针对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的研究进展进行了综述,为乙型脑炎基因工程疫苗的进一步研究提供参考。

猪瘟分子生物学检测技术的研究进展

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失,严重制约着我国养猪产业的发展。文章主要针对猪瘟病毒的反转录-聚合酶链式反应技术、反转录巢式PCR技术、多重反转录-聚合酶链式反应技术、反转录实时荧光定量PCR技术及环介导等温核酸扩增技术等5种分子生物学检测技术的国内外最新研究进展进行综述,以期提高对猪瘟病毒早期感染和隐性带毒猪的检出率,淘汰野毒感染猪群,为猪瘟的净化和防控提供重要诊断参考依据。

贵州一动物园黑叶猴支原体及继发链球菌感染的诊治

贵州一动物园饲养有国家Ⅰ级保护动物黑叶猴发生气喘、咳血等症状,且已病死2只。为查明病因,通过临床症状观察、病理剖检、细菌分离培养、生化鉴定和PCR检测等方法进行诊断。结果表明该黑叶猴为支原体和链球菌感染;且根据细菌药敏试验结果,制定出相应的防治措施。