罂粟碱通过调节自噬对肝癌细胞放射敏感性的影响

为探究罂粟碱(Papaverine,PPV)和细胞自噬在原发性肝癌放射敏感性中的作用机理,将肝癌HepG2、Huh7细胞进行X射线照射,并将细胞分为阴性对照(NC)组、罂粟碱(PPV)组、单纯照射(IR)组,然后采用CCK8实验检测细胞的增殖情况,划痕实验检测细胞迁移情况,克隆形成实验检测细胞放射敏感性,实时定量PCR(RT-PCR)实验检测LC3B、ATG7 mRNA表达情况,蛋白免疫印迹(Western blot)实验检测自噬相关标志物LC3B、p62、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达情况。研究结果显示,与NC组相比,罂粟碱对肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖有明显的抑制作用(P<0.05),并可以抑制肝癌细胞的迁移能力(P<0.05),显著降低肝癌细胞LC3B、ATG7 mRNA的表达水平(P<0.05)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白表达,提高p62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白表达。此外,罂粟碱还可以提高肝癌细胞的放射治疗(RT)效果。上述结果表明罂粟碱通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制HepG2、Huh7细胞自噬,从而抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力,并提高肝癌细胞放射敏感性。

SLC1A5对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株放射敏感性的影响及作用机制

目的探讨溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株放射敏感性的影响及其作用机制。方法采用直线加速器X射线和SLC1A5抑制剂L-γ-谷氨酰-对-硝基苯胺(L-γ-glutamyl-p-nitroanilide,GPNA)处理三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株,选取4 Gy、8 Gy剂量单独照射或分别联合3 mmol/L GPNA处理,采用CCK-8法检测细胞增殖能力;然后选取8 Gy剂量单独照射或联合3 mmol/L GPNA进行处理,分为对照组(DMSO组)、SLC1A5抑制剂组(GPNA组)、照射组(IR组)、联合组(IR+GPNA组)。采用细胞克隆形成实验、划痕实验、Transwell小室实验分别检测细胞克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力。采用活性氧(reactive oxygen species,ROS)荧光探针(DCFH-DA)检测细胞内的ROS水平,丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒检测细胞内的MDA含量,Mito-Tracker Red CMXRos染色实验观察细胞线粒体形态,RT-qPCR法检测前列素内环氧化物合成酶2(prostaglandin synthase 2,PTGS2)基因的表达水平。结果与DMSO组相比,4 Gy组、8 Gy组、4 Gy+GPNA组和8 Gy+GPNA组细胞增殖能力均下降(均P<0.01),且4 Gy+GPNA组、8 Gy+GPNA组细胞增殖能力均低于对应的单纯照射组(均P<0.01),其中高辐射剂量组下降更明显;与DMSO组相比,IR组、GPNA组和IR+GPNA组的细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力均降低(均P<0.01),且IR+GPNA组降低更明显。与DMSO组相比,GPNA组、IR组和IR+GPNA组都存在不同程度的细胞内ROS水平增加,线粒体形态缩小,MDA含量升高以及PTGS2基因表达升高(均P<0.05),其中IR+GPNA组变化更为明显。结论SLC1A5抑制剂在照射的基础上进一步抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,提高细胞放射敏感性,其机制可能与铁死亡激活有关。

照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中PD-L1介导免疫抑制的影响

三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer,TNBC)中外泌体(Exosomes)携带的细胞程序性死亡-配体1(Programmed Cell DeathLigand 1,PD-L1)与肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)免疫抑制相关。为探讨照射能否调节PD-L1的表达从而改善TME的作用,本研究首先通过RT-qPCR和Western blot检测自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)、自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)及蛋白酶体抑制剂MG132在联合或不联合照射下PD-L1、LC3B和P62蛋白的表达情况;其次,采用细胞免疫荧光检测照射前后PD-L1的表达及定位改变;再次,采用Western blot检测照射前后外泌体中PD-L1(sEVs-PD-L1)的表达;最后,采用生物信息学对ATG7与乳腺癌预后、信号通路的相关性进行分析。结果显示:PD-L1在TNBC中的表达高于非三阴性乳腺癌(non-TNBC);PD-L1可通过自噬-溶酶体降解,照射后诱导自噬可以促进PD-L1的胞浆转移及下调sEVs-PD-L1的表达,具体机制可能与信号转导和转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)的激活及外泌体转运相关。上述结果说明照射可以通过影响自噬及外泌体的发生,使PD-L1在微环境中表达下调,进而调控肿瘤介导的免疫抑制。

自噬对肝癌SMMC-7721细胞侵袭迁移能力的影响

为探讨自噬对照射过程中肝癌SMMC-7721细胞侵袭和迁移能力的影响及其潜在的作用机制,将肝癌SMMC-7721细胞分为6组,分别为阴性对照(NC)组、8 Gy X-线照射(IR)组、自噬激活剂雷帕霉素(Rapa)组、自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-MA)组、照射+雷帕霉素(IR+Rapa)组和照射+三甲基腺嘌呤(IR+3-MA)组,利用划痕实验和Transwell实验检测自噬对肝癌SMMC-7721细胞迁移和侵袭的影响;用CCK8实验检测照射、雷帕霉素和3-MA对肝癌细胞增殖的影响;用蛋白免疫印迹(Western blot)检测N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和LC3B蛋白表达情况。研究结果显示,照射可增强肝癌SMMC-7721细胞侵袭迁移的能力(P<0.05),同时,照射可抑制细胞的增殖能力(P<0.05);雷帕霉素激活自噬可增强细胞的侵袭迁移能力(P<0.05),3-MA抑制自噬可抑制细胞侵袭迁移和细胞的增殖能力(P<0.05)。照射可上调N-cadherin、Vimentin表达水平(P<0.05),激活或抑制自噬可分别增加或抑制N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平(P<0.05)。表明X-线照射可激活自噬,促进细胞上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的发生。激活自噬可以提高肝癌细胞上皮间质转化进而促进肝癌细胞侵袭迁移;反之,抑制自噬可阻碍肝癌细胞的侵袭迁移。

自噬在肝癌SMMC-7721细胞DNA放射损伤修复中的影响

目的:探究自噬在肝癌SMMC-7721细胞DNA放射损伤修复中的影响。方法:用X射线照射肝癌SMMC-7721细胞,细胞分为对照(NC)组、单纯照射(IR)组、IR+自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin)组、IR+自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-MA)组。彗星实验分析DNA损伤,Western blotting和细胞免疫荧光分别检测LC3B和γ-H2AX蛋白表达。结果:与NC组相比,随着照射剂量增加,IR组DNA损伤严重,γ-H2AX和LC3B蛋白表达升高(P<0.05)。与IR组相比,IR+Rapamycin组γ-H2AX蛋白表达降低,IR+3-MA组γ-H2AX蛋白表达升高(P<0.05)。结论:照射可引起肝癌SMMC-7721细胞DNA损伤,同时可诱导自噬激活;自噬可促进DNA损伤修复。