骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病之间免疫浸润相关基因的筛选及验证

背景:骨髓增生异常综合征具有较高的急性髓系白血病转化风险,有研究表明免疫浸润在二者之间发挥重要作用,但免疫细胞浸润与相关差异表达基因的调控关系仍需更多研究证实。目的:通过生物信息学分析方法,寻找与骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病具有预后意义的差异表达基因,探讨差异基因与免疫浸润细胞调控在疾病发生发展中的可能作用及机制。方法:利用GEO数据集筛选差异表达基因用于生物信息学分析,对差异表达基因进行DO、GO、KEGG和GSEA分析。利用TCGA预后数据库绘制差异表达基因的K-M曲线,并对预后相关的差异基因进行受试者工作特征曲线分析判断基因的临床诊断性能。最后,采用CIBERSORT分析预后相关关键基因与免疫浸润细胞分布之间的相关性,利用RT-qPCR检测健康对照、骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病患者外周血样本对筛选出的关键基因进行初步验证。结果与结论:①在骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病之间共获得150个差异表达基因,其中16个基因表达上调,134个基因表达下调;②DO、GO、KEGG及GSEA分析结果提示差异表达基因可能通过调节免疫应答促进骨髓增生异常综合征向急性髓系白血病发展,CIBERSORT分析显示骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病之间存在免疫浸润差异,其中CD4+T细胞、单核细胞、中性粒细胞、M1巨噬细胞在急性髓系白血病患者中分布降低,而炎症抑制细胞M2巨噬细胞在急性髓系白血病患者中分布增加,可能与急性髓系白血病免疫抑制有关;③利用K-M曲线及受试者工作特征曲线从150个差异基因中筛选出4个与免疫和预后相关且具有较好诊断性能的基因:MANSC1、FLT3、BMX及CXCR2;④RT-qPCR检测结果显示MANSC1、BMX及CXCR2在急性髓系白血病患者中低表达,而FLT3在急性髓系白血病患者中高表达。结果表明,MANSC1、FLT3、BMX及CXCR2在骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病患者间差异表达,不仅与患者预后显著相关,还可能通过调节患者的免疫浸润影响骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的发生和进展,它们可作为骨髓增生异常综合征向急性髓系白血病转化的潜在生物标志物和治疗靶点,为骨髓增生异常综合征“转白”的临床诊疗研究提供新的方向。

PEITC诱导人AML-M2白血病细胞凋亡机制的初步探讨

目的证实苯乙基异硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)诱导人急性髓系白血病(AML)M2白血病细胞系Kasumi-1细胞凋亡的效应,初步探讨PEITC诱导Kasumi-1细胞凋亡的机制。方法培养人M2白血病细胞株Kasumi-1细胞,CCK-8法检测不同浓度PEITC处理后Kasumi-1细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测药物诱导细胞凋亡和活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的情况;Real-time PCR及Western blot检测HO-1以及凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9mRNA及蛋白水平的变化。结果 CCK-8结果显示PEITC作用Kasumi-1细胞24h、48h、72h后,细胞增殖抑制率呈现浓度-时间依赖性。流式细胞术显示PEITC能够诱导Kasumi-1细胞的凋亡。Real-time PCR及Western blot结果显示PEITC处理细胞后,HO-1表达下降,而凋亡相关基因Caspase3、Caspase8、Caspase9的表达上调。DCFH-DA探针法显示PEITC作用Kasumi-1细胞后,ROS生成增多。结论 PEITC能够促进Kasumi-1细胞凋亡,呈时间剂量梯度依赖关系;PEITC诱导Kasumi-1细胞凋亡可能通过的机制包括下调HO-1表达促进ROS生成及凋亡相关基因Caspase3、Caspase8、Caspase9的激活。

胃癌长链非编码RNA SNHG16异常表达及其临床病理意义

目的:检测长链非编码RNA SNHG16在胃癌组织与癌旁组织中的表达及其临床意义。方法:实时荧光定量PCR(quantitative real time-PCR,qRT-PCR)法检测SNHG16在41例胃癌组织及5株不同分化程度细胞系和胃黏膜上皮细胞中的表达情况,分析SNHG16表达与胃癌临床病理的相关性。结果:胃癌组织中SNHG16相对于癌旁组织其表达量为(2.64±1.59),表达显著上调且与胃癌侵袭相关(P<0.05,r=0.361)。与GES-1细胞株比较,HGC-27中SNHG16相对表达量为(4.21±0.69),MGC-803为(1.99±0.21),BGC-803为(1.90±0.44),SGC-7901为(0.76±0.05),AGS为(3.36±0.81);SNHG16在SGC-7901中低表达,但差异无统计学意义(P>0.05),在其他4株细胞中显著高表达(P<0.01)。结论:SNHG16在胃癌组织中高表达,且其表达水平与胃癌侵袭程度相关,可成为胃癌预后监测及治疗的靶点。

长链非编码RNA SNHG16对胃癌细胞AGS增殖的影响

目的:探讨长链非编码RNA SNHG16对胃癌细胞AGS增殖调控的影响。方法:AGS细胞分control组(正常培养的AGS细胞,C组)、negative control组(转染si-NC序列,NC组)及si-SNHG16组(转染si-SNHG16序列,SI组),通过siRNA干扰技术敲低lncRNA SNHG16后,采用逆转录-实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)验证AGS细胞中SNHG16的表达水平,CCK-8法检测敲低lncRNA SNHG16后AGS细胞增殖能力的改变,流式细胞术检测AGS细胞周期的改变,Western blot检测AGS细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)及细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂家族成员p21蛋白表达水平的改变。结果:敲低lncRNA SNHG16后,与NC组相比,SI组中lncRNA SNHG16的表达显著降低(P <0. 01),细胞增殖能力受到明显抑制,细胞周期阻滞在G0/G1期,细胞周期相关蛋白cyclin D1及CDK6表达下调,p21明显上调(P均<0. 01)。结论:敲低lncRNA SNHG16可能通过上调p21影响胃癌细胞AGS的增殖。

POCT血糖仪与全自动生化分析仪血糖测定结果比对分析

随着糖尿病（DM）患者的增多,血糖的检测越来越受到重视。良好的血糖控制,使血糖接近正常水平,可以大大延缓或减少糖尿病患者各种并发症的产生或减少产生的趋势。因此自我血糖监测具有重要意义,通过监测可直接了解机体实际的血糖水平,并及早发现因过度的血糖控制而产生的低血糖[1]。便携式血糖仪（POCT血糖仪）床旁检验是目前检验医学发展最大迅速的领域。

血清总淀粉酶测定在急性胰腺炎诊断中的价值及存在问题

目的对87例临床急腹症患者,采取静脉血测定血清总淀粉酶活力,以探讨其对急性胰腺炎的诊断价值及存在问题。方法计算血清总淀粉酶测定对急性胰腺炎诊断的敏感度、特异度及准确度。结果血清总淀粉酶对急性胰腺炎诊断的敏感度、特异度及准确度分别为92.31%、81.25%、86.21%。结论血清总淀粉酶测定对急性胰腺炎早期诊断具很大价值,但对发病后期的诊断意义仍有待进一步探讨;如同时检测其他酶以及做影像学检查,则诊断急性胰腺炎价值将明显提高。

同型半胱氨酸与冠脉病变严重程度的相关性研究(附34例报告)

已有大量资料证实同型半胱氨酸（homocysteine,HCY）为冠心病的独立危险因素之一。Boushey等[1]指出：普通人群中冠心病（CHD）危险性的10%归因于高HCY血症,提出血浆浓度每增加5μmol/L,冠心病风险增高70%,脑血管病风险增高50%。本文通过对冠状动脉造影诊断为冠心病患者的HCY血清水平进行研究,以进一步了解HCY血清水平与冠脉病变的严重程度的关系。

调控血红素加氧酶-1诱导K562A02细胞增殖、凋亡及耐药机制研究

目的通过血红素加氧酶-1(HO-1)诱导剂Hemin及抑制剂ZNPP IX调控HO-1,并联合阿霉素逆转K562A02细胞化疗耐药机制的研究,为慢性髓系白血病(CML)的逆转耐药提供新的策略。方法培养K562及K562A02细胞,采用荧光原位杂交(FISH)法检测K562A02细胞中bcr-abl融合基因表达。分别用HO-1诱导剂Hemin及抑制剂ZNPP IX调控HO-1基因表达联合阿霉素处理K562A02细胞后;流式细胞术检测药物诱导细胞凋亡情况。Western blot检测耐药相关基因及凋亡基因蛋白表达水平。结果 K562A02细胞中bcr-abl融合基因阳性细胞占94%。阿霉素处理细胞后,随着阿霉素浓度的增加,HO-1表达下降,耐药相关基因MDR1、NF-κB(P65)、MRP1、TopoⅡα、ABCD2表达亦降低;用HO-1诱导剂Hemin、抑制剂ZNPP IX、阿霉素单药分别及联合处理K562A02细胞后,显示HO-1高表达后耐药相关基因表达升高,细胞凋亡率下降。而降低HO-1表达,耐药相关基因表达下降,细胞凋亡率增加。结论 HO-1可作为逆转耐药的靶基因,可以使K562A02对阿霉素重新敏感,起到增敏效应。

蛋白酶体抑制剂MG132诱导胃癌细胞AGS凋亡的机制研究

目的蛋白酶体抑制剂MG132已在几种肿瘤治疗中取得一定疗效,但MG132对胃癌细胞凋亡的作用机制尚不完全清楚。因此,本文主要探讨MG132对胃癌细胞AGS凋亡的影响及其可能机制,旨在为胃癌治疗提供实验基础。方法选择AGS细胞为研究对象,实验分为6个组(MG132浓度分别为0、0.5、1、2.5、5、10μmol·L^(-1)),利用CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶(detect lactate dehydrogenase,LDH)水平,免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)探讨脑型糖原磷酸化酶(brain-type glycogen phosphorylase,PYGB)、受体相互作用蛋白3(receptor interacting protein 3,RIP3)和受体相互作用蛋白1(receptor interacting protein1,RIP1)的相互作用关系,进一步用Western blot检测PYGB、RIP3和RIP1的表达情况。结果不同浓度MG132处理AGS细胞12、24、36 h后,MG132存在浓度和时间依赖性抑制AGS细胞增殖;MG132处理AGS细胞24 h后,诱导AGS细胞凋亡,促进细胞内LDH释放和ROS水平增加;MG132处理AGS细胞24 h后,细胞内PYGB表达水平降低,RIP3和RIP1表达水平升高。此外,IP实验表明PYGB、RIP3和RIP1之间存在相互作用。结论在胃癌细胞AGS中,MG132诱导的AGS细胞凋亡与PYGB表达水平降低,RIP3和RIP1表达水平升高有关。

下调清道夫受体B类成员1表达对胃癌细胞AGS增殖、迁移及侵袭的影响

目的探讨清道夫受体B类成员1(SCARB1)对胃癌细胞(AGS)增殖、迁移及侵袭的影响及其机制。方法采用RT-qPCR和Western blot检测SCARB1在人胃黏膜上皮细胞GES1和人胃癌细胞AGS中的表达水平;将AGS细胞随机分为空白对照组、阴性对照组和实验组,在实验组中使用RNA干扰技术下调SCARB1表达,阴性对照组使用siRNA阴性序列进行转染,空白对照组不转染siRNA;克隆形成实验和细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法评估各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,细胞划痕实验和Transwell实验分析各组细胞横向迁移、纵向迁移和侵袭能力,Western blot检测基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)及PI3K/AKT通路相关蛋白的表达。结果与GES1细胞比较,SCARB1在AGS中表达升高(P<0.05),AGS细胞SCARB1干扰效率为(68.06±2.04)%;实验组细胞克隆形成率下降,在转染24 h、48 h及72 h时细胞活力均低于阴性对照组,实验组细胞凋亡率高于阴性对照组(P<0.05),阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义;实验组在24 h和48 h的平均划痕宽度大于阴性对照组,48 h时细胞迁移和侵袭数量少于阴性对照组(P<0.05),阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义;实验组MMP2、MMP9、AKT、p-AKT(ser473)、PI3K(p110)表达下降,p-AKT/AKT减少(P<0.05),阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义。结论SCARB1在AGS中高表达,下调SCARB1表达作用于PI3K/AKT信号通路和MMP2、MMP9蛋白而抑制胃癌细胞AGS增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡。

孕妇血清中游离胎儿DNA的分离及鉴定

目的:建立一种稳定的提取母体血清DNA和鉴定胎儿DNA的方法。方法:采用裂解液煮沸法提取孕早、中、后期共90例孕妇血清DNA,应用PCR技术及亲子鉴定原理检测孕妇血清及夫妇双方DYZ1基因、DXS6804、DXS6799和D18S51以确认母体血清中胎儿DNA。结果:男胎孕妇血清中DNA DYZ1基因早、中、晚期的检出率分别为75%、88.89%、100%;血清中胎儿DNA的DXS6804、DXS6799、D18S51的孕早、中、后期检出率分别是76.67%、93.33%、100%。结论:裂解液煮沸法能提取孕妇血清游离DNA,且简便、快捷、提取效率高,可用于后续产前诊断;孕妇血清中存在胎儿游离DNA,并随孕周的增加而明显增加;STR位点扩增及亲子鉴定方法的应用,弥补了DYZ1序列仅能用于鉴定男性胎儿DNA的不足,可作为一种鉴定胎儿DNA的更为可靠的方法;X-STR(DXS6804、DXS6799)和Y染色体上的DYZ1位点可用于胎儿性别的鉴定,为性连锁遗传病的早期筛选提供了一种新的方法。

胃癌高表达转录本1对胃癌细胞株AGS增殖、周期的影响及其机制

目的观察胃癌高表达转录本1(GHET1)对胃癌细胞株AGS增殖、周期的影响,并探讨其机制。方法将干扰序列si-GHET1、阴性对照序列si-NC、空白对照序列转染进AGS细胞中(分别计为干扰组、阴性组、空白组),采用real-time PCR法检测各组细胞GHET1,CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,Western blotting法检测细胞周期相关蛋白。结果干扰组、阴性组、空白组GHET1相对表达量分别为0.42±0.06、1、1.15±0.19,干扰组与其余两组比较,P均<0.05;48 h细胞OD450值分别为0.57±0.04、0.93±0.05、1.03±0.06,72 h细胞OD450值分别为0.69±0.10、1.54±0.08、1.58±0.14,干扰组与其余两组比较,P均<0.05;G0/G1期细胞比例分别为62.01%±4.56%、47.03%±3.36%、44.65%±3.44%,S期细胞比例分别为20.34%±3.29%、32.25%±1.78%、32.96%±2.58%,干扰组与其余两组比较,P均<0.05;CDK2相对表达量分别为0.60±0.08、0.81±0.07、0.81±0.02,CDK4相对表达量分别为0.57±0.03、0.89±0.08、0.87±0.06,CDK6相对表达量分别为0.62±0.09、0.86±0.07、0.92±0.07,Cyclin D相对表达量分别为0.58±0.03、0.74±0.02、0.70±0.04,Cyclin E相对表达量分别为0.33±0.03、0.39±0.01、0.39±0.01,干扰组与其余两组比较,P均<0.05。结论 GHET1可促进AGS细胞增殖,缩短细胞周期,其机制可能通过上调细胞周期相关蛋白表达来实现。

Ⅲ期胃癌患者根治术后复发转移特征及预后影响因素

目的探讨Ⅲ期胃癌(GC)患者行GC根治术后复发转移的特征及预后影响因素。方法选取行GC根治术的Ⅲ期GC患者181例为研究对象,收集患者临床资料[性别、年龄、Tumor-Node-Metastasis(TNM)分期、N分期,肿瘤部位];分别于术前1周及术后转移时采集所有患者空腹静脉血,采用迈瑞6800血球分析仪检测患者常规血液指标及血小板(PLT),用罗氏Cobas c702全自动生化分析仪和罗氏Cobas e602电化学发光免疫分析仪检测患者血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原199(CA199)、糖类抗原153(CA153)、糖类抗原242(CA242);术后随访2~80个月,记录患者发生复发转移部位和时间;根据术后是否发生复发转移,将患者分为复发转移组(n=30)与无复发转移组(n=151),比较2组患者术前上述血液生化指标,比较复发转移组Ⅲ期GC患者转移前、后血清CEA、CA125、CA199水平;运用Cox单因素及多因素分析影响Ⅲ期GC患者预后的危险因素,采用Kaplan-Meier(K-M)法分析Ⅲ期GC患者术后1、2及3年的总体生存率。结果约90%的复发转移Ⅲ期GC患者于术后0~24个月内出现复发转移者,这些患者术前血清TP、ALB低于无复发转移组(P<0.05),且发生复发转移后血清CEA、CA125、CA199水平较转移前升高(P<0.05);术前血清CA125含量≥35 kU/L(HR=3.508,95%CI为1.548~7.950)、术后复发转移(HR=2.613,95%CI为1.576~4.333)是Ⅲ期GC术后患者预后的独立危险因素(P<0.05),且复发转移组Ⅲ期GC患者的中位生存时间低于无复发转移组(P<0.001)。结论术前低水平血清TP、ALB是Ⅲ期GC患者术后出现复发转移的危险因素;术前高水平血清CA125(CA125含量≥35 kU/L)、术后复发转移是Ⅲ期GC术后患者预后的不良因素。

ALDH2基因rs671单核苷酸多态性位点发生(A→G)RNA编辑

目的探讨乙醛脱氢酶2(ALDH2)rs671单核苷酸多态性(SNP)个体在RNA水平发生的改变。方法收集贵州医科大学附属医院体检者的外周抗凝全血48份。分别以人外周抗凝全血白细胞的DNA和互补脱氧核糖核酸(cDNA)为模板进行聚合酶链反应(PCR)扩增,然后对PCR产物进行Sanger测序鉴定受试者的ALDH2 rs671SNP位点和对应的cDNA的序列。结果48例受试者ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3种基因型的基因频率分别为58.3%、39.6%和2.1%,并且所有受试者ALDH2 rs671SNP位点对应的cDNA的序列一致,都表现为“G”。结论48例受试者中,基因型表现为罕见的ALDH2 rs671(AA)的个体ALDH2 mRNA可能发生(A→G)RNA编辑。

ABCA1通过激活EGFR/STAT3信号通路对胃癌上皮间质转化的影响

目的探讨ATP结合盒亚家族A成员1(ABCA1)对人胃癌侵袭、迁移及上皮间质转化(EMT)的影响及其机制。方法基于网络数据库进行生物信息学分析ABCA1在人胃癌中的表达及其与胃癌患者预后的关系。RT-qPCR检测25对临床胃癌组织样本中ABCA1表达情况;RT-qPCR及Western blot分析ABCA1在不同人胃癌细胞系中的表达;利用基因沉默技术构建稳定低表达ABCA1胃癌细胞株。Transwell实验检测细胞迁移和侵袭;Western blot测定EMT及表皮生长因子受体(EGFR)/信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)信号通路相关蛋白的表达。结果生物信息学分析结果显示ABCA1在胃癌中高表达,且与胃癌的分级、分期及不良预后呈正相关。RT-qPCR结果显示ABCA1在胃癌组织和胃癌细胞HGC-27中高表达;Transwell实验结果表明,敲低ABCA1能够抑制HGC-27细胞侵袭和迁移。Western blot结果表明,ABCA1敲低组间质细胞标记蛋白(Vimentin、N-Cadherin)和EMT相关的转录因子(Twist、Zeb1及Snail)表达下调,而上皮细胞标记蛋白E-Cadherin表达上调。Western blot结果提示,与对照组相比,敲低ABCA1抑制了EGFR下游分子STAT3的表达,并使得EGFR及其下游分子STAT3磷酸化水平降低。结论ABCA1在胃癌中表达上调且与胃癌的侵袭、迁移、EMT及不良预后相关。ABCA1可能通过调节EGFR来影响STAT3的表达及激活,从而抑制胃癌细胞的侵袭、迁移及EMT。

PCR-电化学基因芯片法在人乳头瘤病毒感染检测中的价值

目的对PCR-电化学基因芯片法检测人乳头瘤病毒(HPV)核酸进行方法学评价。方法收集贵州省某三甲医院309例宫颈脱落细胞有效样本,采用PCR-电化学基因芯片法检测人乳头瘤病毒并分型,以Sanger测序法为金标准,并与临床常用的荧光PCR法作比较,分别统计分析PCR-电化学基因芯片法与Sanger测序法和荧光PCR法检测结果的一致性和差异,并比较PCR-电化学基因芯片法和荧光PCR法的诊断效能。结果采用3种方法分别对309例有效样本进行HPV检测,均检测到20种不同的HPV基因型;PCR-电化学基因芯片法与Sanger测序法(Kappa=0.955,P<0.001)和荧光PCR法(Kappa=0.944,P<0.001)检测结果均有较高的一致性;与测序法金标准相比,PCR-电化学基因芯片法出现4例假阴性,1例分型结果不一致;PCR-电化学基因芯片法的敏感性为98.44%、特异性为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为92.86%、符合率为98.71%,荧光PCR法敏感性为100%、特异性为98.08%、阳性预测值为99.61%、阴性预测值为92.86%和符合率为99.68%。结论PCR-电化学基因芯片法与Sanger测序法和荧光PCR法的一致性良好,且具有高特异性和阳性预测值,可作为临床HPV感染检测方法的补充。

胃癌组织中α肌动蛋白4表达及其对胃癌AGS细胞迁移的影响

目的探讨胃癌(GC)组织中α肌动蛋白4(ACTN4)的表达及其对GC细胞系AGS细胞迁移的影响。方法采用癌症基因组图谱(TCGA)数据库预测ACTN4在GC中的表达及ACTN4与GC淋巴结转移、肿瘤分期之间的相关性,采用Kaplan-Meier Plotter数据库对ACTN4表达水平在GC中的预后价值进行评估;取对数生长期的GC细胞系AGS、MKN45、HGC-27、MGC803、胃正常黏膜细胞系GES-1与20例GC患者的GC组织及其癌旁组织,采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测细胞系和组织中ACTN4 mRNA及蛋白表达;慢病毒构建GC ACTN4敲低模型,采用划痕实验检测AGS细胞迁移能力。结果数据库数据分析发现ACTN4在GC组织中高表达且表达水平与GC淋巴结转移及肿瘤分期呈正相关(P<0.05);Kaplan-Meier Plotter数据库分析表明ACTN4与GC预后不良呈正相关(P<0.05);ACTN4在AGS细胞系中高于GES-1、在GC组织中高于癌旁组织(P<0.05),敲低ACTN4后GC细胞系AGS的迁移能力减弱(P<0.05)。结论ACTN4在GC中高表达且促进AGS细胞的迁移。

长基因间非编码RNA963不同可变剪接体在胃癌细胞系中的表达和作用

目的探讨长基因间非编码RNA963(LINC 00963)不同可变剪接体(V)在胃癌(GC)细胞系中的表达和作用。方法取对数生长期的GC细胞系AGS、MKN45、HGC-27、MGC803及胃正常黏膜细胞系GES-1,采用常规聚合酶链式反应(PCR)扩增LINC 00963、扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和克隆测序验证LINC 00963存在于GC中的多个可变剪接体,采用荧光定量PCR检测上述细胞中LINC 00963 V表达量、5′cDNA末端快速扩增技术(5′RACE)分析LINC 00963 V的转录起始位点、美国国家生物技术信息中心(NCBI)开放阅读框查找器初步分析不同V蛋白编码能力;取对数生长期GC HGC-27细胞,采用基因沉默技术敲低LINC 00963-V1,设对照(si-NC)组和敲低组(si-V1-a、si-V1-b及si-V1-a+b),免疫印迹分析各组HGC-27细胞中BCL2相关X凋亡调节因子(Bax)、BCL2凋亡调节因子(Bcl-2)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达。结果克隆测序及琼脂糖凝胶电泳明确LINC 00963基因至少存在3个未见报道的V,分别命名为LINC 00963-V1、V2及V3;实时荧光定量PCR结果显示,与GES-1细胞系相比,LINC 00963-V1、V2在HGC-27细胞系中高表达(P<0.05);5′RACE探寻到多个转录起始位点,开放阅读框分析显示新发现的V蛋白编码能力较弱;与si-NC组相比,si-V1-a、si-V1-b及si-V1-a+b组HGC-27细胞Caspase-3表达增高、Bcl-2表达降低,si-V1-a组和si-V1-b组Bax表达增高(P<0.05)。结论LINC 00963存在3个及以上未见报道的V,其中V1在GC细胞系中高表达且有抑制肿瘤细胞凋亡相关基因表达的作用。

下调ANRIL对Kasumi-1细胞增殖和凋亡的影响及其相关作用机制研究

目的:探讨下调ANRIL(Antisense non-coding RNA in the INK4 Locus)表达对Kasumi-1细胞增殖和凋亡的影响及其相关分子机制。方法:使用重组慢病毒构建下调ANRIL表达的Kasumi-1细胞(sh-ANRIL组)及其对照组细胞(sh-NC组),荧光显微镜观察慢病毒对细胞的转染效率,RT-qPCR检测敲低效率及急性髓细胞白血病(AML)患者外周血和骨髓中ANRIL的表达水平。CCK-8法和流式细胞术检测下调ANRIL表达对Kasumi-1细胞增殖和凋亡的影响。Western blot检测下调ANRIL表达后Kasumi-1细胞中PI3K、AKT、p-AKT等相关蛋白分子的表达。结果:ANRIL在AML患者外周血和骨髓中呈高表达;重组慢病毒对Kasumi-1细胞的转染效率>90%,敲低效率为70%;CCK-8结果显示,下调Kasumi-1细胞中ANRIL表达能够显著抑制细胞增殖,当DNR作用24、48、72 h,sh-ANRIL组的细胞增殖抑制率分别为(47.40±1.49)%、(69.11±0.51)%和(91.82±1.10)%,均显著高于sh-NC组(40.69±1.70)%(P<0.05)、(58.93±1.74)%(P<0.01)和(82.93±0.37)%(P<0.001);流式细胞术分析显示,sh-ANRIL组细胞凋亡率为(10.29±0.58)%,显著高于sh-NC组的(5.42±0.67)%(P<0.01),当DNR作用24 h,sh-ANRIL组细胞凋亡率为(54.41±1.69)%,显著高于sh-NC组的(38.28±1.42)%(P<0.001);Western blot结果显示,sh-ANRIL组PI3K、p-AKT、PCNA、BCL-2蛋白水平较sh-NC组显著降低,而BAX蛋白的表达增加。结论:ANRIL可能通过PI3K/AKT信号通路影响Kasumi-1细胞增殖和凋亡,ANRIL是AML的潜在治疗靶点。

乙醛脱氢酶2基因的可变剪接分析

目的 探讨胃癌细胞中的乙醛脱氢酶2(ALDH2) m RNA发生可变剪接。方法 设计ALDH2基因特异性引物,用胃癌细胞(AGS、HGC-27、MKN45)、正常人胃黏膜上皮细胞GES-1和人外周全血白细胞提取RNA,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,然后对ALDH2扩增产物进行测序分析;使用DNAStar软件分析ALDH2变异体(V)的开放阅读框(ORF)。结果 ALDH2变异体1(V1)外显子2和外显子4发生可变剪接,V1外显子1的3’端和外显子3的5’端3个不同的位点发生可变剪接,V1存在8个长度超过100氨基酸的ORF。结论 ALDH2 m RNA存在多种可变剪接形式,提示其存在复杂的蛋白表达功能。