基于网络药理学和分子对接探讨积雪草酸抑制炎症巨噬细胞铁死亡的作用机制及初步验证

目的:采用网络药理学和分子对接方法探讨积雪草酸(AA)调控铁死亡的作用机制,并在脂多糖(LPS)诱导的炎症巨噬细胞模型上进行初步验证。方法:检索SwissTargetPrediction、SEA Search Server、HERB等9个数据库获得AA相关靶点,通过FerrDb 2.0、GeneCards 5.14、KEGG、NCBI等数据库获取铁死亡相关靶点,利用Venny 2.1.0在线工具映射获得AA和铁死亡的交集靶点。采用DAVID 6.9数据库对交集靶点进行GO和KEGG富集分析,String 11.5数据库和Cytoscape 3.9.1软件构建蛋白质相互作用(PPI)网络,并采用CytoHubba插件筛选出核心靶点。最后采用Autodock Tool 1.5.7软件将AA与核心靶点进行分子对接,Pymol 4.2软件对分子对接结果可视化。构建LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型,激光共聚焦法检测AA对炎症巨噬细胞内脂质活性氧(lipid ROS)荧光强度的影响;细胞免疫荧光法检测AA和Akt激活剂SC79对谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、p-Akt表达的影响。结果:网络药理学分析共筛选出203个AA与铁死亡交集靶点。富集分析结果显示,AA可能通过AKT1等核心靶点介导PI3K/Akt等信号通路调控铁死亡;分子对接结果显示,AA与AKT1等核心靶点均能稳定结合。在LPS诱导的巨噬细胞,AA明显降低巨噬细胞lipid ROS荧光强度,增强GPX4而减弱p-Akt荧光表达(与LPS组比较,P<0.01);SC79使AA增强GPX4表达的作用明显减弱(与单用AA比较,P<0.01)。结论:AA抑制炎症巨噬细胞铁死亡,机制可能与负调控Akt活性有关。

基于网络药理学和巨噬细胞炎症模型探讨积雪草酸抗动脉粥样硬化的作用机制

目的:基于网络药理学和巨噬细胞炎症模型探讨积雪草酸(AA)抗动脉粥样硬化(AS)的作用机制。方法:首先,通过Swiss Target Prediction、CTD、GeneCards数据库获取AA相关靶点,GeneCards、TTD数据库获取AS相关靶点,之后通过Venny 2.1.0在线工具映射获得AA与AS的交集靶点。采用String 11.5数据库和Cytoscape 3.7.2软件构建交集靶点的蛋白相互作用(PPI)网络图并筛选出核心靶点;通过David 6.8数据库对交集靶点进行GO和KEGG通路富集分析,并通过微生信在线工具对富集结果进行可视化。最后采用Cytoscape 3.7.2软件构建出“药物—靶点—疾病—通路”网络模型图。构建脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型,通过ELISA法检测TNF-α释放水平,Annexin V-APC/7-AAD双染色法流式细胞术及Western blotting检测细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达,验证AA对巨噬细胞炎症和凋亡的影响。结果:网络药理学预测共获得AA抗AS的潜在作用靶点84个,GO和KEGG分析结果显示AA抗AS机制可能与调控TNF、NOD样受体、凋亡及PPAR等信号通路有关。细胞实验结果显示,与LPS组比较,AA高、低剂量组TNF-α水平降低,细胞凋亡率和Bax、Cyt C蛋白表达进一步提高,而Bcl-2蛋白表达下降(P<0.05或P<0.01)。结论:AA可通过多靶点、多通路发挥抗AS作用,诱导巨噬细胞凋亡和抗炎为其作用机制之一。

塞来昔布联合齐留通对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响

目的:探讨环加氧酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布联合5-脂加氧酶(5-LO)抑制剂齐留通对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化(AS)病变的影响及机制。方法:雄性ApoE^(-/-)小鼠随机分成AS模型组、塞来昔布组(80 mg/kg/d)及塞来昔布联合齐留通(400 mg/kg/d)组(高脂饲料喂养),野生型雄性C57BL/6J小鼠为正常对照组(普通饲料喂养),每组12只。每日灌胃给药18周后,取血测定血脂水平,小动物B超下测量主动脉弓斑块面积比(%)、主动脉全长油红O染色测量阳性斑块面积比(%)及主动脉根部切片苏木精-伊红(HE)染色测量斑块面积比(%)和内中膜厚度(IMT)并观察AS病理形态学改变,ELISA测定主动脉匀浆花生四烯酸(AA)代谢产物前列腺素E2(PGE2)和白三烯(LTs)[包括白三烯B4(LTB4)和半胱氨酰白三烯(CysLTs)]含量。结果:与正常对照组比较,AS模型组小鼠血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)水平明显升高(P<0.05或P<0.01),但总甘油三酯(TG)水平无明显改变(P>0.05);塞来昔布组及塞来昔布联合齐留通组血脂各指标与AS模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。小动物B超、主动脉全长油红O染色及主动脉根部切片HE染色病理学观察及定量检测结果均表明AS模型组小鼠形成了明显的主动脉AS病变,塞来昔布加重AS病变,塞来昔布联合齐留通减轻塞来昔布加重的AS病变(均P<0.05或P<0.01)。AS模型组小鼠主动脉匀浆PGE2、LTB4和CysLTs含量均较正常对照组显著升高(P<0.01);与AS模型组相比,塞来昔布组小鼠主动脉匀浆PGE2含量显著降低,而LTB4和CysLTs含量则显著升高(P<0.01);与塞来昔布组相比,塞来昔布联合齐留通组主动脉匀浆PGE2含量无明显改变(P>0.05),但LTB4和CysLTs含量明显降低(P<0.01)。结论:塞来昔布上调LTs加重ApoE^(-/-)小鼠AS病变的作用可被5-LO抑制剂齐留通逆转。