RagA缺失果蝇的构建及表型分析

【目的】Rag GTPase是真核生物中高度保守的Ras家族蛋白,在调节雷帕霉素靶点复合体1(mechanic target of rapamycin complex 1, mTORC1)活性和自噬等方面发挥重要作用。为了研究Rag GTPase的生理功能,本研究构建了RagA基因编码区缺失的突变黑腹果蝇Drosophila melanogaster,对其表型进行分析。【方法】将靶向RagA基因的gRNA表达质粒导入表达Cas9蛋白的黑腹果蝇中,随后通过PCR方法筛选获得RagA编码区缺失的RagA突变黑腹果蝇;利用遗传杂交的方法对腹果蝇RagA突变体的生殖及存活情况进行分析;利用FLP-FRT系统分别在脂肪体和雌性卵巢中诱导产生RagA突变的细胞克隆,分别分析RagA突变细胞生长和自噬水平的改变。【结果】利用CRISPR-cas9结合显微注射技术成功敲除RagA基因;RagA突变导致黑腹果蝇在胚胎期死亡,在细胞水平上使细胞生长明显降低、细胞内LAMP1和Rab7标记的自噬溶酶体堆积。【结论】本研究验证了RagA基因调节细胞代谢的功能,为进一步利用RagA突变果蝇研究RagA基因在发育中的功能分析和机制解析奠定基础。

GAL4/UAS系统在果蝇Tis11基因RNA干扰中的应用

TTP在哺乳动物许多关键基因表达的转录后水平上起调控作用,Tis11是TTP蛋白在果蝇中的同源物.目前还没有现成的可用于研究Tis11功能的基因敲除或敲低的果蝇.为了获得肌动蛋白启动子或者热激蛋白启动子驱动表达Tis11 mRNA干扰序列的具有较高干扰效率的Tis11基因干扰果蝇,将肌动蛋白启动子或者热激启动子驱动表达的GAL4果蝇品系与融合有Tis11 mRNA干扰序列的UAS品系杂交,收集同时带有GAL4基因和UAS序列的子一代果蝇.提取所收集果蝇的总RNA,将其中的mRNA逆转录成cDNA,并设计检测Tis11基因的特异性引物,然后通过Real-time PCR检测Tis11 mRNA的表达情况.结果显示所收集的能表达Tis11基因干扰序列的子一代果蝇与不能表达Tis11基因干扰序列的对照果蝇相比,其体内Tis11 mRNA的表达水平下降明显.收集的果蝇其体内所表达的干扰序列对Tis11 mRNA干扰效果显著,我们成功获得了Tis11基因的RNA干扰果蝇.

利用果蝇细胞研究基因表达转录后调控的双报告基因系统的建立

目的 构建能够在果蝇S2＊细胞中检测转录后调控元件对基因表达调控影响的双报告基因系统.方法 首先利用pAc5.1/V5-His c,pGL3-basic和pRL-SV40载体,构建能在果蝇体系中表达萤火虫荧光素酶的报告基因质粒pAc-Fluc,以及用作内参照表达海洋腔肠荧光素酶的质粒pAc-Rluc.将TNF-α基因mRNA的3＇UTR连接至pAc-Fluc的Luc编码区下游构建pAc-Fluc-TNF-α质粒,并与pAc-Rluc共转至果蝇S2＊细胞,检测两种荧光素酶的相对活性.结果 成功构建了能够在果蝇S2＊细胞中组成型表达的双报告基因系统;在TNF-α mRNA 3＇UTR控制下表达的荧光素酶活性比对照有显著下降.结论 可以利用该双报告基因系统在果蝇细胞中研究转录后调控元件对基因的表达调控.

结合GAL4/UAS系统与CyO-GFP平衡子获取表达RNA干扰序列果蝇幼虫并有效干扰Tis11表达

TIS11是转录后调控因子TTP在果蝇中的同源物,在果蝇幼虫免疫、发育和代谢等多种生理过程中都发挥重要作用.为研究TIS11的功能,需要利用GAL4/UAS系统获得整体高干扰效率的Tis11 RNAi果蝇幼虫.为平衡GAL4转基因果蝇高活性启动子的致死效应,需要使用带有成蝇卷翅标记CyO的第二染色体的平衡子,但CyO标记在幼虫中无可见表型,因此无法区分杂交幼虫的基因型.为解决这一问题,引入了带有CyO-GFP标记的平衡子.携带CyO-GFP平衡子的G-Actin果蝇与携带Tis11 RNAi序列的101765果蝇杂交,杂交幼虫可以通过GFP标记进行区分,剔除带有CyOGFP平衡子的幼虫,从而挑选出表达Tis11 RNAi序列的幼虫,最后经real-time PCR检测所得幼虫具有整体高干扰效率.

本科生基因工程实验课程基因克隆构建方案

将常用于Gateway克隆系统中的对大肠杆菌具有毒性ccdB基因引入载体,提高基因克隆成功率。构建基因克隆过程中,含有ccdB基因的原始载体在大肠杆菌中不能正常生长,无法形成细胞克隆,避免空载的假阳性克隆产生。通过分组比较实验、启发引导的教学设计,可以让学生充分领会酶切、重组、连接等生物工程相关操作,加深学生对理论课程的理解。该基因克隆方法的改进能够满足实验教学的需要,也适用于科研工作中的基因克隆效率的提高。

RagA转基因果蝇的构建及功能研究

Rag GTPase属于Ras家族成员的GTP结合蛋白,定位于溶酶体。果蝇RagA蛋白是哺乳动物RagA/RagB蛋白同源物,在果蝇中RagA与RagC结合,共同调节TORC1活性。本实验室发现敲减RagA使果蝇发育停滞在蛹期。为了探究具体原因,基于密码子的简并性,通过融合PCR、同源重组克隆的方法构建了改变RagA RNA干扰靶标位点的过表达载体pUASp-RagAwt;在此基础上,通过点突变的方式构建了与GTP结合的RagA过表达载体pUASp-RagA-Q61L和与GDP结合的RagA过表达载体pUASp-RagA-T16N。通过显微注射和遗传杂交等方式分别筛选出pUASp-RagA-wt、pUASp-RagA-Q61L、pUASp-RagA-T16N转基因果蝇。通过体细胞克隆的方法检测了不同活性状态的RagA对TORC1活性的影响,RagA调节TORC1活性:与GTP结合处于激活态;与GDP结合处于失活态。为确定GTP/GDP状态下RagA活性对果蝇发育的影响,将UASp转基因系果蝇与Tub-Gal4/TM6果蝇杂交并统计后代羽化率,判断由GTP/GDP状态控制的RagA活性对果蝇生长发育的影响。结果发现,RagA敲减果蝇由于蛹期阶段内出现障碍不能发育为成虫。在RagA敲减的背景下,过表达野生型RagA能够完全挽救RagA敲减所导致的果蝇致死。过表达GTP结合型的RagA-Q61L能够部分挽救RagA敲减的致死效应,过表达GDP结合型的RagA-T16N不能挽救RagA敲减的致死效应。表明RagA在果蝇生长发育过程中起着重要的作用,且RagA与GTP/GDP结合需保持动态平衡。RagA仅与GTP或GDP结合会使TORC1活性处于过高或过低的状态,影响果蝇的生长发育。

浅析农业推广在农业种植业发展中的重要性及应用

农业种植业发展离不开技术创新及推广,应在农业结构战略调整的指导下,积极开展农业推广工作。对农业推广在农业种植业发展中的重要性进行了分析,进而提出了几点农业推广的应用对策,具体包括新品种推广、新农药推广、新技术推广等,以期为农业种植业的发展提供参考。

沙门菌果蝇感染致死模型构建及其评价

目的为了比较不同沙门菌对果蝇致死毒力,建立果蝇沙门菌肠道感染模型,并进行模型评价。方法将鼠伤寒沙门菌SL1344、14028S和肠炎沙门菌C50041及其突变株C50041ΔspiC,以OD_(600)为100的高浓度菌液通过饲喂法和针刺法,分别感染30只CS型果蝇和yw型果蝇,每隔3 h观察活果蝇数,计算存活率,分析沙门菌毒力。结果肠炎沙门菌C50041和C50041ΔspiC饲喂果蝇,120小时后CS型果蝇存活率0%,yw型果蝇的存活率低于20%,而针刺法感染CS型果蝇和yw型果蝇存活率则高于80%;鼠伤寒沙门菌饲喂法感染CS型果蝇和yw型果蝇,其存活率均高于90%。针刺法存活率均高于60%。比较分析显示,鼠伤寒沙门菌肠道感染耐受和肠炎沙门菌肠道感染敏感,存在明显的差异;肠炎沙门菌对果蝇肠道感染模式的毒力明显高于非肠道感染模式,不同果蝇品系之间则无明显的差异。结论本研究中,果蝇沙门菌肠道感染模型被成功建立,并能够评价不同沙门菌的毒力,其中肠炎沙门菌C50041果蝇肠道感染呈高度敏感,为后续肠炎沙门菌功能基因鉴定研究奠定基础,便于深入研究沙门菌致病机理。

RagA和Nprl2在果蝇肠道发育中的调节作用关系

动物胃肠道是食物消化和营养吸收器官,对机体健康至关重要。果蝇与哺乳动物的肠道在细胞组成、遗传调控等方面高度相似,是研究肠道发育的良好模型。体外培养细胞中的研究发现,Nprl2通过作用于Rag GTPase,抑制雷帕霉素靶点复合物1(target of rapamycin complex 1,TORC1)的活性,参与细胞代谢的调节。前期报道nprl2突变果蝇具有前胃增大、消化能力降低等肠道衰老相关表型。但对于Nprl2是否通过Rag GTPase调控肠道发育等方面尚不清楚。为了探究Rag GTPase在Nprl2调控果蝇肠道发育中的作用,本研究利用遗传杂交结合免疫荧光等方法对RagA敲减和nprl2突变果蝇的肠道形态、肠道细胞组成等方面进行研究。发现单独敲减RagA可以引起肠变粗、前胃增大等表型,敲减RagA能挽救nprl2突变体中肠道变细、分泌型细胞减少的表型,但并不能挽救nprl2突变体中前胃增大的表型。以上结果表明,RagA在肠道发育中发挥重要作用,Nprl2通过作用于Rag GTPase调节肠道细胞分化和肠道形态,但Nprl2对前胃发育和肠道的消化功能的调节可能通过不依赖于Rag GTPase的机制实现。

妊娠期糖尿病患者氧化应激水平变化及临床意义

目的:研究GDM孕妇与正常孕妇血清MDA、SOD及GSH水平变化,探索它们与GDM之间的相互关系,追踪各组妊娠结局研究其临床意义。方法:选取175例孕妇为研究对象,分为GDM组(93例)和对照组(82例)。采用微量法测定血清丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)水平,并对妊娠结局进行相关性分析。结果:(1) GDM组年龄、孕前体重、BMI值均高于对照组,GSH和SOD水平均低于对照组,MDA水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);(2) GDM组MDA水平与孕前体重呈负相关(r=-0.3547,P<0.05),SOD水平与新生儿出生体重呈正相关(r=0.3292,P<0.05),SOD值与早产之间有密切联系(足月产12.68±0.85 vs.早产8.08±1.18, P <0.05),GSH、SOD水平与孕前体重之间,MDA、GSH水平与新生儿出生体重之间,MDA、GSH水平与早产之间均无明显相关性(P>0.05),MDA、GSH和SOD水平与剖宫产及胎膜早破均无明显相关性(P>0.05)。结论:GDM存在明显的氧化应激反应,GSH、MDA与SOD可以作为评估GDM氧化应激的有效标志物,其与不良妊娠结局有关。