鸭疫里默氏杆菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

根据GenBank登录的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白(OmpA)基因保守区序列,设计引物和探针,建立了直接检测鸭疫里默氏杆菌的实时荧光定量PCR快速方法。10倍梯度稀释RA菌株制备DNA模板测定方法的灵敏度,结果可在8.0×103CFU/mL浓度下特异地检测出目的菌,最低能检测到RA的DNA模板为8.0拷贝/μL;对鸭源大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌进行检测,结果均为阴性,建立的实时荧光定时PCR方法特异性强。用RA菌株人工感染雏鸭,感染后定时采集咽喉拭子、泄殖腔拭子、心血、肝脏、肺脏、脑,分别用实时荧光定量PCR检测,对脏器进行病原菌分离。结果表明,1/10半数致死量接种组,感染后8 h从心血、肝脏、脑组织检测到RA核酸,16 h后全部试样呈阳性;24 h首先从肝脏分离到RA,心血、肝脏、肺脏、脑组织均分离出RA。心血和脏器RA实时荧光定量PCR阳性检出率为63.8%(51/80),RA分离率为28.8%(23/80)。10个半数致死量接种组,1 h即可从咽喉拭子、心血和肝检测到RA核酸,5 h全部样品为阳性;5 h从肺和脑分离到RA。RA人工感染鸭的心血、肝脏、肺脏、脑实时荧光定量PCR阳性检出率为86.3%(69/80),RA分离率为60%(48/80)。用加热裂解法提取样品RA DNA只需30 min,建立的实时荧光定量PCR检测RA只需2 h,适用于RA的快速诊断、流行病学调查、种鸭引进隔离检疫、活鸭及其产品国内市场和进出口检验检疫。

水体病毒钙离子絮凝浓缩新方法研究

研究建立了一种从水体中浓缩病毒的新方法,即钙离子絮凝-柠檬酸缓冲液洗溶法,该方法的要点是先用一定量的钙离子溶液和钙离子絮凝剂絮凝水体中的病毒,再用pH5.0的0.3mol/L的柠檬酸缓冲液洗溶,然后再进一步超滤浓缩。此法可方便地将水体中的病毒浓缩10000倍以上。应用该法分别对人工播种于饮用水中的f2噬菌体和脊髓灰质炎疫苗病毒(PV1)进行了浓缩,结果发现f2噬菌体的平均回收率达96%,而PV1的回收率为100%,均显著高于阳电膜过滤法(P<0.05)。该方法快速、简便、有效。

实验猴志贺氏菌检出、血清分型及药物敏感性试验

采用实验动物国家标准(GB/T 14926.47-2001)的检验方法,对144份待出口实验猴粪便样品检测,检出志贺氏菌2株,阳性检出率1.39%。血清学分型,均属于B群志贺氏菌,血清型分别为X变种和Y变种。药敏试验结果表明,2株分离菌对先锋V、氟哌酸和环丙沙星高度敏感,而对青霉素、红霉素和复方新诺明耐药。

水体病毒浓缩方法的建立和优化研究

采用氯化钙(CaC l2)、聚乙二醇(PEG,pH7.0)、聚乙二醇(PEG,pH11.5)、三氯化铝(A lC l3)沉淀、Am icon Utcra超滤离心装置和硝酸纤维素吸附膜6种浓缩方法,浓缩人工添加于水体的1型脊髓灰质炎疫苗病毒(PV1),并对浓缩实验条件进行选择和优化。结果表明,CaC l2和聚乙二醇(pH7.0)沉淀法适用于浓缩大容量水体中的病毒,而超滤离心管浓缩法适用于小容量水体,这3种浓缩方法的病毒回收率均达到100%。

沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank提供的沙门菌invA基因序列和志贺菌ipaH基因序列设计引物，建立了二重PCR方法，在同一反应体系同时检测两种致病菌核酸，经二重PCR方法扩增后，在同一泳道同时检出沙门菌284bp和志贺菌611bp特异性扩增条带，而普通大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、阪畸大肠埃希菌、绿脓杆菌、蜡样芽胞杆菌、马链球菌、产单核细胞李斯特菌、鹅大肠埃希菌、猪水肿病大肠埃希菌均未出现这两种条带。对PCR产物进行测序，测序结果与已发表的基因核苷酸序列比较，沙门菌同源性为93％～100％，志贺菌同源性为98％～100％。应用建立的沙门菌和志贺菌二重PCR方法对广西6个试验猴养殖场1665份猴粪便样品进行检测，检出沙门菌阳性25份，志贺菌阳性90份，阳性检出率分别为1．5％和5．4％。表明建立的沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法特异性强、敏感性高，适用于临床粪便样品的快速检测。

食品沙门氏菌实时荧光PCR快速检测方法建立

根据Genbank提供的沙门氏菌ttrBCA基因序列设计引物和探针,建立了食品沙门氏菌实时荧光PCR快速检测方法。结果显示,该方法只对沙门氏菌基因呈阳性反应,而对其它常见非阳性菌株(志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、单增李斯特氏菌、阴沟肠杆菌、副溶血性弧菌)基因组DNA均呈阴性反应,对模拟添加沙门氏菌样品检测,检测低限为240cfu/mL沙门氏菌的DNA,检测食品样品增菌液,仅需约3h,结果表明,该方法适用于食品样品的快速检测。

猪圆环2型病毒环介导等温扩增实时检测方法的建立与评价

以猪圆环2型病毒为材料,设计了2对引物,构建了猪圆环2型病毒实时环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并进行敏感性和特异性确定。建立的猪圆环2型病毒实时LAMP检测方法,通过应用实时浊度仪可以对猪圆环2型病毒进行快速检测。

猪细小病毒PCR检测与分离研究

根据猪细小病毒(PPV)结构蛋白VP2基因序列,设计合成1对引物,建立了检测PPV的PCR方法.检测14份临床组织,检出阳性11份,阳性检出率为79.5%.阳性样品扩增产物用EcoRⅠ酶切得到了预期的结果,对PCR产物进行测序,测序结果与已发表的PPV基因核苷酸序列比较,同源性达99%～100%,所编码的氨基酸同源性为93%～100%.从PCR检测阳性的一份病料组织中分离出1株PPV.试验证明,建立的PPV PCR检测方法特异性强、敏感性高,适用于临床样品的快速检测.

鹅金黄色葡萄球菌的分离及鉴定

从采自死亡肉鹅肝和脾病料中分离到一株细菌 ,经细菌形态学观察 ,鉴别培养 ,梅里埃微生物全自动分析仪检验 ,血浆凝固酶试验鉴定为金黄色葡萄球菌。该分离菌株对小白鼠有致病性 ,动物回归试验中 ,能使雏鹅发病并全部死亡。从而证明本病的病原为致病性金黄色葡萄球菌。药敏试验结果表明 ,该菌株对环丙沙星、先锋 V、毒霉素和氨苄青霉素高度敏感 ,而对复方新诺明不敏感。

倾注法与涂布法对蜂蜜中嗜渗酵母计数的比较分析

本研究旨在建立准确、可靠、稳定的检测蜂蜜中嗜渗酵母计数的分析方法。分别采用GB 14963-2011中嗜渗酵母计数的涂布方法以及GB 4789.2-2010中菌落总数测定的倾注法,对蜂蜜样品中的嗜渗酵母计数。并通过以上两种不同方式对不同温度下储藏的蜂蜜样品进行比较试验。结果发现同一样品、同一稀释度、同样的培养条件下,使用倾注法测得的嗜渗酵母数量比涂布法更多,差异极显著(P<0.01)。对经不同温度下储藏的蜂蜜样品进行嗜渗酵母计数,各浓度条件下倾注法计数结果比涂布法更多,差异极显著(P<0.01)。

应用聚合酶链反应快速检测试验猴沙门氏菌和志贺氏菌

根据Genebank提供的沙门氏菌invA基因序列和志贺氏菌ipaH基因序列设计引物,分别建立了检测2种致病菌的PCR方法。应用于检测临床试验猴粪便样品85份,检出沙门氏菌阳性3份,志贺氏菌阳性9份,阳性检出率分别为3.5%和10.6%。试验证明建立的沙门氏菌和志贺氏菌PCR检测方法特异性强、敏感性高,适用于试验猴临床粪便样品的快速检测。

鹅金黄色葡萄球菌的分离与鉴定

从死亡肉鹅的肝和脾病料中分离到一株细菌 ,经细菌形态学观察、鉴别培养、梅里埃微生物全自动分析仪检测、血浆凝固酶试验鉴定为金黄色葡萄球菌 ;该分离菌株对小白鼠有致病性 ,动物回归试验中 ,能使雏鹅发病并全部死亡 ;药敏试验结果表明 ,该菌株对环丙沙星、先锋V、青霉素和氨苄青霉素高度敏感 ,而对复方新诺明不敏感。

食用香料添加剂-桂粉中蜡样芽胞杆菌的分离与鉴定

从送检的待出口食用香料添加剂-桂粉中分离一株出疑似蜡样芽胞杆菌。经细菌形态学观察、葡萄糖发酵试验、硝酸盐还原试验、V-P试验、L-酪氨酸分解试验、溶菌酶试验、卵磷脂酶试验、动力试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质结晶毒素试验等证实分离菌株为蜡样芽胞。

食蟹猴在登革热及其疫苗研究中的应用进展

登革热是由登革病毒引起、伊蚊传播的一种严重传染性疾病,广泛流行于全球热带和亚热带地区,人感染后会突发高热、严重头痛、肌肉和关节痛以及出疹,有时伴发登革出血热等致命并发症.食蟹猴是登革热病毒的自然宿主,且又是生物医学研究最重要的实验动物之一,因此,探索食蟹猴在登革热病研究中的应用可以很好地促进对登革热发病机制的认识及登革热疫苗研发与治疗方法的研究.本文简要介绍食蟹猴在登革热研究中的应用和最新研究进展,为登革热动物模型的研究提供更多参考.