新型冠状病毒亚单位疫苗研制及其高效免疫增强剂的筛选

旨为推动新型冠状病毒(2019-nCoV)亚单位疫苗的开发并探索筛选适用于该疫苗的高效免疫增强剂,本试验分别诱导表达2019-nCoV-S和2019-nCoV-N两个蛋白,经纯化后测定目的蛋白含量,并分别加入不同浓度的松花粉多糖(PPPS)(200、400、800 mg/mL)作为佐剂制备基因工程亚单位疫苗,黄芪多糖佐剂作为对照。选取100只SPF级BALB/c小鼠随机分为10组,每种亚单位疫苗使用5组,免疫疫苗后检测各组小鼠免疫指标,探讨PPPS对2019-nCoV-S和2019-nCoV-N两种亚单位疫苗的免疫增强效果。结果显示,重组表达并纯化的目的蛋白分别在55.68 kD和45.64 kD处出现单一条带,经鉴定表达正确,蛋白质量浓度分别为1.12 mg/mL和0.66 mg/mL。用制作成的含佐剂亚单位疫苗免疫小鼠后发现400 mg/mL PPPS对两种疫苗的免疫效果均有显著的提升效果,并且效果优于黄芪多糖佐剂。综上所述,两种重组蛋白均能诱导较高的抗体水平,PPPS可以作为2019-nCoV亚单位疫苗的候选佐剂。

C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌二价二联类毒素疫苗的创制及其效果评价

羊肠毒血症、羊快疫发病急死亡快,一般采用免疫接种疫苗的方式才可以有效防控。本研究将C型产气荚膜梭菌的外毒素、D型产气荚膜梭菌外毒素和重组腐败梭菌α毒素按一定比例混合,经甲醛灭活乳化后制成二价二联类毒素疫苗。参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》分别对疫苗进行了安全性检验、无菌检验和免疫效力检验等。6~7月龄的绵羊接种本疫苗21 d后,通过间接ELISA和毒素中和试验检测绵羊血清中抗体效价。免疫效果显示,绵羊血清中抗C型产气荚膜梭菌毒素的抗体效价为1:3200,抗D型产气荚膜梭菌毒素的抗体效价为1:6400,抗腐败梭菌毒素的抗体效价为1:6400;而中和效价分别为1:400,1:800和1:800。说明本实验所制备的疫苗效价较高,且安全可靠,能够为绵羊提供可靠的抗感染保护。该二价二联复合类毒素疫苗是国内首创,使疫苗的抗原成分由菌体上升为毒素蛋白,具有鲜明的创新。

鸭RIG-1基因的PCR扩增及其序列分析

维甲酸诱导基因1(RIG-1)是细胞质中侦测病原相关分子模式的识别受体。论文旨在扩增北京鸭RIG-1编码基因,并对其进行序列分析。通过PCR方法,从北京鸭脾脏中扩增得到RIG-1基因cDNA,并使用LaserGene分子生物学分析软件进行序列分析。结果发现北京鸭的RIG-1基因cDNA开放阅读框全长2 802bp,编码933个氨基酸。结构预测发现鸭RIG-1结构与哺乳动物类似,N端有两个串联CARD区,中间为DExD/H解旋酶区,C端为抑制区,各功能区起重要作用的氨基酸较为保守。同源性及进化树分析发现鸭RIG-1与鹅和斑马鱼的同源性最高分别为93.7%、78.4%,与哺乳动物同源性高于50%,与其他鱼类的同源性低于50%。成功扩增出北京鸭RIG-1基因cDNA编码序列,为鸭RIG-1的深入研究奠定了基础。

一株鸭源H3N6亚型禽流感病毒遗传进化分析

从活禽交易市场健康鸭体内分离到一株H3N6亚型禽流感病毒,命名为A/Duck/Guangdong/E9/2012(H3N6),这是该亚型禽流感病毒在我国广东地区的首次分离报道。为分析其遗传进化特征,对该病毒全基因组序列进行了测定,进行了遗传进化分析。结果显示,其HA裂解位点附近的氨基酸序列为PE-KQTR↓GLF,只含有1个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的HA裂解位点氨基酸序列的分子特征;其HA基因与2011年蒙古国分离的鸭源A/Duck/Mongolia/OIE-7457/2011(H3N5)禽流感病毒的HA基因同源性最高,其NA基因与2011年蒙古国分离的鸭源A/Duck/Mongolia/OIE-7438/2011(H4N6)禽流感病毒的NA基因同源性最高。全基因组分子遗传进化分析结果显示,其8个基因均属于欧亚谱系的禽源进化分支。

鸡干扰素调节因子7的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达鸡干扰素调节因子7蛋白并制备其多克隆抗体,通过RT-PCR技术扩增chIRF7基因的编码序列,构建重组质粒PET30a-chIRF7。将重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白rchIRF7分子量约为60ku。将纯化的重组蛋白免疫接种小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA测定血清抗体滴度在1∶51 200以上,IFA检测结果显示制备的鼠抗chIRF7蛋白多抗能够与AIV刺激的CEF细胞内的chIRF7蛋白发生特异性反应,表明通过原核表达系统表达的重组蛋白rchIRF7具有很好的免疫原性,以其制备的鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗体滴度高、特异性好。

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒的分离鉴定

在广东进行流行病学调查时从鹦鹉采集的拭子样本中分离到一株禽流感病毒,应用聚合酶链反应(PCR)、血凝抑制试验(HI)和基因测序等方法技术对其进行了亚型鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且被H5亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制;分别用针对禽流感病毒的M、H5亚型禽流感病毒的HA基因、N2亚型禽流感病毒的NA基因特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增,均扩增出特异性目的片段;测序及BLAST分析表明其与H5N2亚型禽流感美国分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性高达97%以上,由此该分离株鉴定为H5N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Parrot/Guangdong/268/2005。

鸽TLR7基因的克隆、鉴定及表达分析

【目的】克隆鸽Toll样受体(Toll-like receptor 7,TLR7)全基因,预测其主要功能区域并分析在鸽的各种组织中的表达情况.【方法】通过RT-PCR、RACE、相对荧光定量PCR、生物信息学软件分析方法进行研究.【结果和结论】研究发现鸽TLR7基因cDNA全长3 516 bp,ORF全长3 175 bp,编码1 048个氨基酸.其蛋白结构主要由胞外的富含亮氨酸的结构域(LRRs)、跨膜域(TM)和胞内的Toll/白介素-1受体结构域(TIR)3部分构成.鸽TLR7基因编码的氨基酸序列与鸿雁Anser cygnoides、绿头鸭Anas platyrhynchos、鸡Gallus gallus和麻雀Taeniopygia guttata的相似性均高于78%,与哺乳动物的相似性约为60%,与鱼类的相似性低于55%.鸽TLR7基因在小肠、脾脏、肾脏、肝脏中表达量较高,而在大脑、肺脏、气管、心脏、胰腺、肌肉、皮肤中表达量相对较低.该研究克隆了鸽TLR7全基因,并预测其主要功能区域.

一株天鹅源H5N1亚型禽流感病毒的分离鉴定

2004年从广东某地送检的病死天鹅肺组织中分离到1株禽流感病毒,用血凝抑制试验(HI)、聚合酶链反应(PCR)、基因测序等对其进行了亚型鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且H5亚型禽流感病毒标准阳性血清能对其产生特异性抑制作用;分别用针对禽流感病毒M基因、H5亚型禽流感病毒HA基因、N1亚型禽流感病毒NA基因特异性引物对该分离株进行PCR扩增,均获得特异性目的片段;测序及BLAST分析表明HA基因与A/chicken/Viet Nam/Ncvd8/2003(H5N1)的HA基因同源性为98%;NA基因与A/swine/Fujian/1/2003(H5N1)的NA基因同源性为98%,由此该分离株鉴定为H5N1亚型禽流感病毒,按照国际流感病毒系统命名原则将该病毒株暂命名为A/Swan/Guangdong/197/2004。

两株H6N2亚型鸡源禽流感病毒的分离鉴定

本研究利用血凝抑制试验(HI)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因测序等方法,对广东省某活禽交易市场进行流行病学调查时获得的两株非H5、H9亚型禽流感病毒65株和C7株进行了亚型鉴定。结果表明这两株病毒均具有血凝活性,且能被抗H6亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制。用针对禽流感病毒的M基因、H6亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因特异性鉴定引物对65株和C7株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段。测序及BLAST分析表明两株分离株与H6N2亚型禽流感广东分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性均高达95%以上。将该两分离株鉴定为H6N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Chicken/Guangdong/65/2009、A/Chicken/Guangdong/C7/2009。

2020年山东省部分地区鸭圆环病毒感染情况分析

为了解山东省部分地区2020年6~12月份鸭圆环病毒与其他病原体感染的情况,本实验室对从聊城、东营、德州、潍坊、济宁地区送检的130份样品进行了PCR鉴定及药敏试验,其中病毒检测包括:鸭圆环病毒(DuCV)、腺病毒(FAV)、鸭细小病毒(DPV)、禽流感病毒(AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、新型鸭呼肠弧病毒(NDRV)和鸭肝炎病毒(DHV)。结果表明:在130份样品中,76份样品检测出病毒,其中DuCV检出43份,约占56.58%。86份样品检出细菌,占总样本数28.46%;DuCV与细菌混合感染37份,占DuCV阳性样本数86.05%。细菌单纯感染时敏感药物有四种,分别为盐酸环丙沙星、硫酸庆大霉素、氨苄西林钠、阿莫西林;细菌和DuCV混合感染时敏感药物只有两种,分别为硫酸庆大霉素和阿莫西林。说明DuCV在山东省部分地区存在着不同程度的流行,同时与细菌混合感染情况严重且增加了细菌的耐药性。

腐败梭菌胶体金试纸条检测方法的建立及类毒素疫苗的制备和应用

羊快疫(Braxy)是由腐败梭菌引起的急性、致死性传染病,迫切需要建立一种针对羊快疫等腐败梭菌病的快速诊断方法,进行有效检测和防治。因此,本研究创新性地发明了新型腐败梭菌培养方法,并以此为基础,建立了腐败梭菌胶体金检测方法和腐败梭菌类毒素疫苗。胶体金试纸条所制备抗体效价可达到1:1024000,纯化后的抗体最适标记量为10µg/ml,经测定最适标记pH为8.0,胶体金-抗体结合物原液的最佳工作浓度稀释比为1:4。本实验所制备类毒素疫苗免疫小鼠21 d后血清中腐败梭菌毒素抗体效价达到1:6400,接种3.5 ml腐败梭菌类毒素疫苗绵羊免疫21 d后,血清小鼠中和效价达到1:600。经检测,腐败梭菌胶体金检测方法具有较好的特异性和灵敏性,腐败梭菌类毒素疫苗有效抗原成分高,免疫效果理想,抗体效价较高且维持时间较长,为羊快疫的诊断和防控提供了理论依据。

诺维氏梭菌α毒素单克隆抗体的制备与鉴定

诺维氏梭菌是羊黑疫的致病菌,该菌可使1岁以上的绵羊发病,山羊也可以患此病。由诺维氏梭菌引起的羊黑疫发病急,死亡快,家畜往往还没有表现出明显症状就死亡,给畜牧业带来了巨大损失。本研究利用重组诺维氏梭菌ɑ毒素制备单克隆抗体,研究过程中成功制备了2株针对诺维氏梭菌α毒素重组蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为1978CT716.15.65和1978CT142.38.7。对所得2株杂交瘤细胞分泌的抗体进行间接ELISA测抗体效价,最高可达到1:512000。对所获得的2株杂交瘤细胞进行Western Blot分析发现,2种单克隆抗体均能与重组蛋白发生特异性结合。鉴于单克隆抗体具有生物活性单一、纯度相对比较高且与抗原结合特异性强等优势,可以利用单克隆抗体达到快速检测疾病及治疗疾病的目的,为构建快速检测诺维氏梭菌的检测技术和检测方法奠定了基础。

腐败梭菌α毒素蛋白单克隆抗体制备

将腐败梭菌参考株增殖、鉴定,使用饱和硫酸铵沉淀法粗提腐败梭菌天然α毒素,并通过SDS-PAGE方法对其进行检测。将扩增的α毒素目的片段和经酶切的p ET-21a(+)载体同源重组,将构建好的重组质粒转入到BL21(DE3)感受态细胞中,并筛选阳性克隆株。在优化的表达条件下,对α毒素重组蛋白进行了大规模的表达。免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞筛选。制备及纯化腹水,进行效价、浓度、纯度及特异性测定。结果表明,本研究成功表达了可溶性腐败梭菌α毒素蛋白,大小约为46 kDa,筛选出的单抗3 E8和单抗6B12对重组蛋白效价检测结果均为1:256 000,对天然α毒素的效价检测结果均为1:128 000;纯度均已达到85%以上;单克隆抗体的浓度分别为3E8:2.27 mg/ml,6B12:1.96 mg/ml;均能够与腐败梭菌重组α毒素、天然α毒素特异性结合,而与产气荚膜梭菌α毒素无交叉反应。结论:得到特异性强、稳定性高的单抗3E8和单抗6B12,有助于腐败梭菌病的早期诊断及研究。

H7N9亚型AIV荧光定量RT-PCR技术建立及在活禽市场的应用

针对H7N9亚型欧亚谱系AIV的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的序列保守区分别设计特异性引物和TaqMan探针。通过优化反应条件,建立了H7N9亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法。利用该方法对泰安市活禽市场11个月的空气状况进行监测。结果显示:H7和N9基因的最低检测限度分别为100copies/μL和101 copies/μL,检测H7和N9基因的R2值均为0.999。批内和批间试验的变异系数均小于3%。采用该技术,活禽市场空气样品3/114份检测出H7N9阳性。结果表明:本试验建立的H7N9亚型AIV实时荧光定量RT-PCR方法与其他方法相比具有快速、特异和敏感的优点,可为H7N9亚型AIV的监测及早期诊断提供理论依据。

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒分子进化分析

2005年在广东进行流行病学调查时分离到一株鹦鹉源禽流感病毒,经鉴定为H5N2亚型禽流感病毒(A/Parrot/Guangdong/268/2005)。该毒株的HA裂解位点附近的氨基酸序列为RETRGLF,只含有一个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的HA裂解位点附近氨基酸序列的分子特征;与H5N2亚型禽流感代表毒株相比,该毒株HA和NA基因的糖基化位点、HA基因的受体结合位点编码区、NA基因的耐药性位点均未发生变异。将该毒株全基因组序列与GenBank已公布的19株H5N2亚型禽流感病毒株的相应序列进行比较分析并绘制系统进化树后发现:其与低致病性禽流感毒株A/Pheasant/NJ/1355/1998(H5N2)-like的亲缘关系最近,位于以A/Chicken/Pennsylvania/1/1983(H5N2)为代表的美洲进化分支。

H9N2亚型禽流感病毒感染TC-1细胞诱导的免疫反应

为了更好地了解宿主对禽流感病毒(AIV)感染后的免疫反应,本试验以TC-1细胞为模型,感染H9N2亚型AIV。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测了3种模式识别受体(TLR-3、RIG-I和MDA-5)和5种炎性细胞因子(IL-6、RANTES、IP-10、TNF-α和IFN-β)。结果显示:3种模式识别受体中MDA-5上调最为明显,5种炎性因子中RANTES和IP-10上调最为明显;而IL-6、TNF-α和IFN-β上调相对较平缓。本研究结果表明:在病毒感染过程中MDA-5反应较TLR-3和RIG-I更为强烈,而在炎性反应过程中RANTES和IP-10反应更加剧烈,IL-6、TNF-α和IFN-β反应则相对较温和一些。本研究在一定程度上反映了机体对流感病毒的免疫反应机制,为在生产中疫苗的使用具有一定的指导意义。