γ-干扰素ELISA检测方法在广西牛结核病流行病学调查中的应用

【目的】摸清广西水牛及奶牛结核病的流行情况，为制定净化广西牛结核病防制策略提供参考。【方法】2008～2011年采用皮内变态反应和γ-干扰素ELISA检测方法联合对广西奶牛及水牛开展结核病流行病学调查，共检疫5478头奶牛和1580头奶水牛。【结果】2008～2011年从广西南宁、柳州、北海、钦州、桂林等市累积检测出皮内变态反应阳性奶牛63头、水牛17头，阳性检出率分别为1.15％和1.08％，总体上广西奶牛及水牛结核病阳性率呈现逐年降低的趋势。通过采用自制水γ－干扰素EusA检测试剂盒和Bovigam牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒对牛结核病进行检测，发现γ-干扰素ELISA检测的牛结核病阳性率低于皮内变态反应，且准确度高。【结论】对牛群进行结核病检测时，先以变态反应检疫牛群，再结合γ-干扰素ELISA检测进行综合判断，更有利于牛结核病的检测与净化。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达、纯化及鉴定

【目的】通过原核表达及纯化获得A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1,为建立A型FMDV的ELISA诊断方法及开发安全、高效、广谱的新型基因工程疫苗提供技术支持。【方法】以含A型FMDV VP1基因的重组质粒p MD18-T-A-VP1为模板,通过特异性引物扩增A型FMDV的VP1基因,构建表达质粒p ET-32a-VP1和p GEX-6p-1-VP1,然后转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白。【结果】诱导表达获得的VP1融合蛋白主要以包涵体形式存在,分别经His·Bind和GST·Bind柱层析纯化,SDS-PAGE分析结果表明融合蛋白纯度较高;Western blotting检测分析发现,VP1融合蛋白能与豚鼠抗A型FMDV阳性血清发生特异性结合,但不与豚鼠抗O型和Asia1型FMDV阳性血清反应。【结论】经原核表达及纯化获得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特异性和抗原性,可用于易感动物的免疫及血清抗体筛查。

广西家犬及蝙蝠狂犬病病毒监测与分析

为了解广西狂犬病病毒（RV）感染与分布情况,本研究对采集自广西境内9个市31个县（区）1 007份犬脑组织、1 324份犬唾液拭子及564只野生蝙蝠进行RV检测,结果显示有6个县的犬脑组织检测出RV,阳性率为0.65%（1/153）～5.38%（5/93）,县（区）阳性率为27.27%（6/22）,广西划分的5个地理区域均有分布。外观健康犬和疑似发病犬脑组织平均阳性率分别为1%（10/1 005）和100%（2/2）。犬唾液拭子和野生蝙蝠均未检测到RV。结果表明广西家犬的RV感染率存在一定的地域性差异,平均感染率较低,但个别县（区）连续几年阳性率均处于较高水平,应加强对犬只的管理和疫苗免疫。

A型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了深入了解VP1蛋白的结构和功能,并建立A型口蹄疫(FMD)血清抗体检测方法,试验采用纯化的重组蛋白p ET-32a-VP1免疫Balb/c小鼠,以纯化的重组蛋白p GEX-6p-1-VP1作为检测抗原包被酶标板检测抗体效价。将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,其杂交瘤细胞用间接ELISA法进行筛选,获得4株能稳定分泌抗口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1的特异性杂交瘤细胞株,分别命名为1D10、3D12、4E12和5G7。结果表明:这4株单克隆抗体均为Ig M亚型和κ轻链,单克隆抗体间可能识别同一个表位,或表位重叠性大。4株单克隆抗体均能被A型FMDV阳性血清所阻断,具有特异性,且以单克隆抗体4E12产生的抗体效价最高、稳定性强、亲和力最大,并能与重组蛋白FMDV-A-VP1特异性结合。说明单克隆抗体4E12可作为单克隆抗体竞争ELISA法的竞争抗体用于检测A型FMDV血清抗体。

O型口蹄疫病毒VP1基因及其多表位基因的原核表达与纯化鉴定

【目的】通过原核表达并纯化获得O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因及其多表位基因的重组蛋白,为建立O型FMDV抗体ELISA检测试剂盒及制备动物高免血清提供技术支持。【方法】以O型FMDV VP1全基因重组质粒p MD18-T-T-VP1及串联的VP1多表位基因重组质粒p MD18-T-O-VP1为模板,通过特异性引物扩增并回收目的基因,构建重组质粒p ET-32a-VP1和p GEX-6p-1-VP1,然后转入大肠杆菌BL211(DE3)中诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行分析鉴定。【结果】O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到正确表达,表达的两种融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯度较高,且均能与猪抗O型FMDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。【结论】表达获得的融合蛋白具有良好的反应原性,可作为包被抗原应用于O型FMDV抗体检测试剂盒研发。

O型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA诊断方法的初步建立

利用表达的重组融合蛋白pGEX-6P-1-VP1作为抗原,用PET-32a-VP1蛋白免疫家兔获得的阳性血清作为FMDV阳性血清的竞争抗体,建立了检测FMDV抗体的竞争ELISA,并进行了条件优化,利用统计学方法计算竞争ELISA的阳性临界值。结果显示,重组蛋白抗原的最适包被质量浓度为1μg·mL^(-1),待检血清、酶标抗体和高免血清的最佳稀释度分别为1∶40、1∶2000和1∶500;与液相阻断ELISA试剂盒相比较,该方法的敏感性为91.3%,特异性为95.1%,符合率为96.7%。结果表明,该方法敏感性好、特异性强、重复性好,可用于O型FMDV血清抗体水平的检测。

广西猪源H9N2亚型流感病毒的分离与鉴定

用SPF鸡胚从广西地区猪群中分离到1株H9N2型猪流感病毒(SIV),经鸡胚接种3代后出现稳定的鸡血红细胞凝集效价为27,且凝集性能被H9亚型阳性血清抑制,而不被其他亚型流感病毒阳性血清所抑制。分离株的HA基因及NA基因扩增结果显示,该毒株HA基因与流感病毒H9亚型同源性最高,NA基因与流感病毒N2亚型同源性最高,说明该病毒属于H9N2亚型猪流感病毒,命名为A/Swine/Guan-gxi/01/2009。

广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组序列分析

【目的】了解广西猪源H9N2亚型流感病毒的来源及变异情况,为有效防控广西猪源H9N2亚型流感病毒奠定基础。【方法】运用RT-PCR对广西分离株A/SW/GX/S11/05(H9N2)进行全基因组扩增,并克隆测序及对比分析。【结果】扩增获得的HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因片段长度分别为1683、1401、1497、1027、890、2233、2280和2151bp,其推导氨基酸分别为561、467、499、349、338、744、760和717aa。经过序列分析,发现各基因片段的核苷酸及其推导氨基酸与A/Bird/GX/62/05株的同源性最高,分别为96.2%～100.0%和98.5%～99.6%;系统进化分析也表明A/SW/GX/S11/05株与A/Bird/GX/62/05株的亲缘关系最近。【结论】广西猪源H9N2亚型流感病毒属于欧亚谱系的北京亚系,且在一定时间内不同宿主间均有感染,在今后的流感病毒防治工作中,跨种属传播是一个不可忽视的问题。

广西部分地区猪群PEDV N基因克隆及序列分析

【目的】了解广西区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的感染及病毒的遗传变异特点,为更好防控猪流行性腹泻提供科学依据。【方法】应用RT-PCR方法从2012-2016年广西地区25个猪场收集的PEDV病料中扩增出86株PEDV的N基因,并进行序列比对及遗传进化分析。【结果】86株PEDV的N基因核苷酸同源性为94.2%~100.0%,与参考毒株核苷酸同源性为94.1%~100.0%。N基因遗传进化分析显示广西的PEDV可分为2个群,Cluster2由韩国株DR13、日本株83P-5、中国株CH/S以及本研究的GP35-8、LC37-22、LC107-5、LC107-19和LC107-16毒株组成,其他81株毒株属于Cluster 3,包括中国株DX、LJB-03、Hu N、JS-2004-2;Cluster 1和Cluster 4则由其它参考毒株组成。【结论】PEDV是引起广西规模化猪场新生仔猪腹泻的主要病原,广西地区的PEDV流行毒株可分为2个群且其N基因仍然保守。

哺乳仔猪猪瘟的诊断和防控

猪瘟是一种由猪瘟病毒引起的高度接触性传染病,是目前影响我国养猪业最严重的传染病之一〔1,2〕。近几年养猪业的不断发展,猪瘟在不少地方仍不断发生和流行,特别是由于非典型猪瘟和温和性猪瘟的出现,猪瘟的流行病学、临床表现、病理变化方面发生了很大变化,

ELISA技术在家畜疫病诊断中的应用

概述ELISA技术原理、特点和基本类型及其在口蹄疫、猪蓝耳病、猪瘟、猪伪狂犬病、小反刍兽疫等5种家畜疫病诊断应用中涉及的检测标准、试剂种类、影响因素和常见问题,为兽医实验室人员准确掌握ELISA技术提供有益参考。

猪嵴病毒VP1基因序列测定与分析

【目的】对猪嵴病毒（PKV）VP1基因进行测序与同源性分析,确认其可能来源,为今后的生物学特性分析及仔猪腹泻防治工作提供科学依据。【方法】采用RT-PCR对GXPKV-1毒株VP1基因进行克隆,运用DNASTAR软件包中Megalign程序对测序获得的VP1基因进行核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分析。【结果】GXPKV-1毒株VP1基因全长762 bp,共编码254个氨基酸,与Gen Bank已公布的13株参考毒株VP1基因的核苷酸同源性为74.1%～85.4%,推导氨基酸同源性为81.1%～93.3%。根据VP1基因推导氨基酸序列进行系统发育进化分析,发现GXPKV-1毒株与Gansu-2012、JS1419等国内参考毒株同属于同一亚群,而与瑞士分离株Swine-S-1-2007、泰国分离株THA-2008、美国分离株H_24-2012-USA及四川分离株CHN-SC-2011-02等的亲缘关系较远。【结论】猪嵴病毒GXPKV-1毒株起源于国内流行毒株的传播,在新的环境下虽然其VP1基因核苷酸发生变异,但由于同义翻译,推导氨基酸的同源性仍然较高,说明碱基突变并未引起蛋白结构的改变。

猪流行性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)病原的方法,根据GenBenk上的猪流行性腹泻病毒N基因序列,设计合成一对引物,建立了检测PEDV的一步法RT-PCR方法,并对其特异性、灵敏性及重复性进行了研究。结果表明:建立的一步法RT-PCR方法具有较好的特异性、灵敏性及重复性,最低可检测出约1pg PEDV的RNA。该方法为PEDV的病原检测及其分子流行病学调查提供了有效的诊断方法,可用于猪流行性腹泻的早期确诊和病毒鉴定。

资源县鸡新城疫免疫效果监测分析

新城疫是由新城疫病毒引起的鸡急性高度接触性传染病,常呈败血症经过。主要症状是呼吸困难,下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血[1]。目前该病在我国部分地区仍有散发和流行,并表现出宿主范围扩大、病原基因型多样化、免疫带毒现象普遍等流行病学特征,对养禽业生产危害巨大[2]。我县长期落实相关监测方案,将鸡新城疫免疫作为重点工作来抓,免疫密度均保持在95%以上。

猪传染性胸膜肺炎与冬季腹泻混合发病的诊治报告

2011年12月27日接到荔浦县荔城镇沙街村吴家厂一养殖户报告,该场150多头10㎏～12㎏体重的仔猪发生严重咳嗽与腹泻,已于当日早上死亡2头,无法确诊,请求前往帮助诊治。

桂林市仔猪腹泻的调查与防控技术

桂林市年出栏生猪600万头以上,饲养总量与规模长期位于广西前三行列,养猪业在农业中地位越来越重要。在集约化养猪生产循环中,仔猪阶段是提高生产效率最为关键的环节。据统计,仔猪阶段（仔猪出生后~2周）因各种原因造成的死亡率占整个仔猪阶段（出生至断奶后1~2周）的65%左右,而仔猪阶段的死亡率占猪一生死亡率的70%^（[1]）,由此可见,仔猪阶段对疫病的预防与控制好坏对养殖效益起到关键作用。

O型口蹄疫病毒VP1基因主要抗原位点基因串连表达载体的构建及序列测定

以构建好的O型FMDV VP1基因的重组质粒PMD18-T—VP1为模板，通过PCR扩增出VP1基因主要抗原位点VP1（61～180bp）的核苷酸及VP1（421～639bp）的核苷酸，采用重组PCR方法将扩增所得的2个基因片段用linker连接，结果构建出1个含384bp的重组质粒，将该重组质粒定向插入原核表达载体pGEX-6P-1，成功构建了pGEX-6P-1-VP1（384bp）串联表达载体。该串联表达载体的构建为进一步研制FMDV的诊断抗原及多肽疫苗奠定了基础。