绿豆种子组织培养的几种灭菌方法

组织培养的关键是对外植体灭菌,目前效果最佳的灭菌剂氯化汞属于剧毒试剂,对环境及人体均有危害。为探究更加安全有效的灭菌方式,本研究以绿豆为试验材料,以75%乙醇+30%次氯酸钠联合灭菌、4%过碳酸钠、氯气3种灭菌处理方式搭配灭菌时间共8组处理,统计其萌发及污染情况,并在7 d时统计长势相关数据。另外,每组在接种3 d时制备外植体转接至分化培养基,观察统计污染及丛生芽状况,根据数据分析结果选出最优灭菌剂及灭菌时间。结果表明,75%乙醇30 s+30%次氯酸钠30 min处理下其污染率为4%,丛生芽分化率为82%,生长速率与生长状况良好。因此,该方法最适合于绿豆组织培养的种子灭菌,有利于愈伤组织的诱导。

基于绿豆发状根的快速CRISPR/Cas9基因编辑方法

由于缺乏有效稳定的遗传转化体系,导致基因编辑技术在绿豆中的应用受到极大限制,也使绿豆基因功能研究受到极大阻碍。因此,建立一套基于发根农杆菌的操作简便、快速且高效的绿豆嵌合植株转化技术,可以为绿豆基因功能研究提供技术支撑。首先在CRISPR/Cas9载体骨架中插入1个绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达框用于阳性发状根的快速筛选,然后将含有靶标基因gRNA的CRISPR/Cas9质粒导入发根农杆菌K599。菌液注射侵染绿豆幼苗植株下胚轴,评价K599在绿豆中诱导发状根发生及CRISPR/Cas9系统在绿豆转基因发状根组织中的效率。结果显示,K599菌液侵染种植7 d的绿豆幼苗植株并在保湿条件下培养3周可在侵染点诱导发状根产生,此嵌合植株在切除原生根后可在霍格兰培养液中正常生长且培养1周后即可用于后续检测。用GFP筛选的结果显示,阳性发状根占比约为(57.8±10.0)%。随机选择15个荧光检测阳性的转基因发状根组织,利用测序检测靶位点的编辑效果,结果显示有10个靶位点的序列发生了突变,突变比例达到67%,其中碱基缺失突变9个,碱基转换突变1个。由本研究结果可知,利用该方法可以在无菌组织培养的条件下于4周内获得目的基因编辑的转基因组织,极大地便利了绿豆分子水平上的功能研究,也为其他尚缺乏稳定遗传转化体系的作物进行基因功能研究提供了参考。

大豆根特异性GmPR1-9启动子的鉴定及其在根腐病抗性中的应用

【目的】鉴定大豆根特异性启动子及其最小调控片段,并利用启动子工程技术构建时空特异人工启动子并评价其在根腐病抗性中的应用价值,为大豆抗疫霉根腐病的遗传改良提供遗传元件。【方法】通过分析大豆根、茎和叶片转录组数据,筛选在根中特异高水平表达的基因,克隆获得其启动子序列。根据顺式元件的分布位置构建截短载体,并驱动GUS报告基因在大豆发状根组织中超表达,筛选控制根特异性表达的核心片段。将获得的核心启动子片段与疫霉菌诱导启动子元件p4XD串联构建人工启动子驱动疫霉抗性相关基因GmNDR1在大豆发状根中超表达,分析转基因组织对疫霉菌抗性水平及目的基因在病原菌侵染过程中的表达水平。利用转基因本氏烟草从整株水平评价转基因材料对疫霉菌的抗性水平。【结果】通过筛选发现6个大豆根特异性表达的PR1同源基因,其中,pGmPR1-9具有最高的启动子表达活性。PLACE在线预测发现其启动子区域含有大量的根特异表达相关顺式元件。对pGmPR1-9启动子进行截短试验,发现5′端截短片段L1、L2、L3、L4和L5均具有启动GUS表达活性,长度为166 bp的L5(-166—-1)片段具有全长启动子80%的活性,并可驱动GUS在转基因烟草根中特异表达;3个3′端截短片段R1、R2、R3和1个双端截短片段M1几乎检测不到GUS酶活性。p4XD-L5融合片段驱动GmNDR1在大豆发状根中超表达后可显著提高大豆发状根对疫霉菌的抗性,超表达发状根接种病原菌后发病程度和病斑长度显著低于对照,疫霉菌丝积累量在接种48 h时减少66.5%。GmNDR1在超表达组织中始终维持在高表达水平,在接种前,表达量是对照组织的39.2倍,接种后,表达量受疫霉菌侵染诱导进一步上调,并在36 h达到最高。GmNDR1在p4XD-L5::NDR1转基因本氏烟草根中的表达量显著高于茎和叶片,表现出明显的根部表达偏好性。超表达株系接种辣椒疫霉菌15 d后的株高、根长和鲜重显著高于对照,同时叶片萎蔫率和病斑长度显著低于对照植株。【结论】鉴定获得一个大豆根特异性表达启动子及其核心序列,融合诱导性和组织特异性启动子核心元件的人工启动子p4XD-L5驱动抗性基因GmNDR1超表达,可显著增强转基因大豆发状根和本氏烟草对疫霉菌的抗病性。

大豆根系特异表达基因全基因组水平挖掘及其启动子活性鉴定

通过改变根系形态建成和提高根系对逆境的抗性可以有效提高作物产量。鉴定根特异性启动子是研究根系发育和对根部性状进行遗传操作的前提。大豆作为一种重要的作物,目前对其根部特异表达基因及启动子尚缺乏系统性的研究。基于大豆幼苗期根、茎、叶片组织的基因转录组数据,本文对大豆根特异或偏好表达的基因启动子进行了挖掘,并通过RT-PCR方法对其中105个候选基因进行了验证,获得33个根特异表达基因,并克隆了其中11个基因启动子(pro1~pro11)。对转基因大豆发状根组织和稳定转化本氏烟草幼苗植株进行GUS染色,结果表明11个启动子均具有显著的根部特异或偏好表达活性。在大豆发状根中,由pro1、pro2、pro8和pro9启动的GUS基因表达活性达到35S的2倍以上。本研究为大豆及其他作物中组织特异性基因及启动子的研究提供了参考。此外,本研究提供的启动子可用于驱动抗性基因在大豆根系组织中特异表达,从而提高大豆对根部病害的抵抗能力,实现品种改良的目的。