慢病毒沉默Piezo1蛋白与人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ的表达

背景:Piezo1作为机械敏感蛋白与成骨分化密切相关,TAZ也被证明参与调节成骨分化,但Piezo1调控人骨髓间充质干细胞成骨分化时TAZ是否参与其中目前尚不明确,故研究其具体机制对防治股骨头坏死具有重要意义。目的:探讨Piezo1对人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ表达的影响。方法:构建靶向Piezo1的siRNA,转染至293T细胞,通过RT-qPCR检测其沉默效率并筛选出Piezo1-Homo-2337进行包装,使用荧光染色检测其最佳感染复数值。Piezo1沉默重组慢病毒进一步被转染至人骨髓间充质干细胞中,通过RT-qPCR、Western blot检测其沉默效果;通过茜素红染色、碱性磷酸酶活性分析、免疫荧光染色、RT-qPCR及Western blot检测分析沉默Piezo1对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力及TAZ表达的影响。结果与结论:①与正常组、阴性对照组比较,转染si-Piezo1后人骨髓间充质干细胞中Piezo1的mRNA及蛋白水平明显降低;②与阴性对照组比较,si-Piezo1组碱性磷酸酶活性明显降低,钙沉积明显减少;③与阴性对照组比较,si-Piezo1组成骨相关基因Runx2、OPN、DLX5、osteocalcin、β-catenin及TAZ的mRNA水平明显降低。si-Piezo1组TAZ、β-catenin的蛋白表达明显降低;相反,si-Piezo1组p-TAZ、p-β-catenin的蛋白表达明显增加;④与阴性对照组比较,免疫荧光染色结果提示si-Piezo1组人骨髓间充质干细胞中TAZ、β-catenin的表达较少;⑤结果表明Piezo1可促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化,沉默Piezo1后人骨髓间充质干细胞的成骨能力明显降低,同时TAZ的表达也同样降低。

虎杖苷调控HIF-1α/VEGF信号通路对绝经后骨质疏松症大鼠H型血管生成的影响

目的探讨虎杖苷对绝经后骨质疏松症大鼠(PMOP)H型血管生成的影响。方法采用随机数表法将大鼠分为空白组、模型组、虎杖苷组(45 mg/kg),每组10只。除空白组外,其余组采用去卵巢法构建PMOP大鼠模型,灌胃给予相应药物。干预8周后,HE染色观察胫骨近端骨组织病理变化,Micro-CT分析膝关节组织形态变化和骨量变化,免疫组化和免疫荧光分析膝关节HIF-1α、VEGF、CD31、Emcn蛋白表达。结果与空白组比较,模型组骨小梁数量减少,骨小梁不连续,BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th值降低(P<0.01),Tb.Sp值升高(P<0.01),膝关节组织HIF-1α、VEGF、CD31及Emcn蛋白表达降低(P<0.01);与模型组比较,虎杖苷组BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th值升高(P<0.05,P<0.01),Tb.Sp值降低(P<0.01)膝关节组织HIF-1α、VEGF、CD31及Emcn蛋白表达升高(P<0.01)。结论虎杖苷可能通过上调HIF-1α/VEGF信号通路相关蛋白表达来促进H型血管的生成,改善PMOP大鼠的血流供应,从而达到对PMOP的保护作用。

基于免疫炎症-肠道微生态探讨清热解毒方对痛风小鼠治疗作用的研究

目的探究清热解毒方对痛风小鼠抗炎作用及对肠道菌群的影响。方法将40只7~8周龄、体重20~22 g的SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为空白组(CON组)、模型组(MOD组)、别嘌醇组(ALLO组)、清热解毒方组(QRJD组),第1~35天每天早上CON组灌胃10 g/0.1 mL羧甲基纤维素,其余各组均灌胃氧嗪酸钾(500 mg/kg)+酵母膏(10 g/kg)混悬液制备高尿酸血症小鼠模型;第29天在异氟烷麻醉下,往CON组小鼠右踝关节注射50μL无菌羧甲基纤维素,其余各组小鼠右踝关节注射等量尿酸钠溶液(50 mg/mL)制备痛风性关节炎模型,同时各组每天灌服相应药物进行治疗;第35天取材,取材小鼠禁食不禁水6 h,检测血尿酸、血肌酐、尿素氮等血液指标,踝关节苏木精-伊红、番红-固绿染色;踝关节免疫组化检测白细胞介素-10(interleukin 10,IL-10)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)抗炎指标;收集小鼠盲肠内容物,采用16S rDNA高通量测序法检测肠道菌群变化。结果(1)用药治疗7 d后,与MOD组相比,QRJD组能有效降低疾病模型小鼠血尿酸(P<0.001)、肌酐(P<0.01)、尿素氮(P<0.05)浓度,有效保护肾功能。(2)病理结果提示,与MOD组相比,苏木精-伊红染色发现QRJD组治疗后,关节滑膜增生有所减少,炎症细胞浸润得到减轻;番红-固绿发现中药复方软骨排列较前有序,软骨破坏较MOD组减轻,基质未见失染。(3)踝关节免疫组化结果提示CON组、MOD组IL-10、TGF-β1未见明显升高;与MOD组相比,QRJD组的IL-10、TGF-β1表达升高(P<0.05)。(4)肠道菌群交互关系、多样性上,与CON组相比,MOD组特有的OTUs数目增加75个,[JP]而QRJD能减少MOD特有的OTUs数量,更接近CON组;4组间的α多样性未见明显差异(P>0.05),而β多样性发现QRJD组的菌群组成更趋向于CON组水平(P=0.001)。(5)肠道菌群差异分析结果显示,与CON组相比,MOD组Ruminococcaceae spp.、Dubosiella sp.、Tyzzerella sp.、Ileibacterium sp.和Bacteroidales spp.等丰度增高(P<0.05);与MOD组对比,QRJD组Lactobacillus sp.、Ligilactobacillus sp.和Bacteroides sp.等丰度上升(P<0.05),且肠道菌群相互作用图显示菌群之间存在相互作用。(6)肠道菌群与肾功能、抗炎因子相关性分析中,Dubosiella sp.、Tyzzerella sp.、Bacteroidales spp.的相对丰度与SUA、SCR呈显著正相关(P<0.05);而Lactobacillus sp.、Ligilactobacillus sp.、Mitochondria spp.与IL-10、TGF-β1抗炎因子呈正相关,其中与TGF-β1较为显著(P<0.05)。(7)COG功能预测提示QRJD组功能集中于无机离子转运和代谢、碳水化合物运输与代谢等。结论QRJD能有效调节免疫炎症-肠道微生态紊乱从而治疗痛风疾病,推测其防治痛风的机制是调节肠道菌群多样性以及调控Ruminococcaceae spp.、Dubosiella sp、Lactobacillus sp.等差异菌群丰度实现治疗痛风的目的。

活血通络法对激素性股骨头坏死囊性变患者血清骨吸收/成血管/成骨蛋白调节作用的研究

背景激素性股骨头坏死(SIONFH)中囊性变具有“双刃剑”作用,活血通络法对早期激素性股骨头坏死疗效佳,但对囊性变骨吸收/成血管/成骨蛋白调节作用尚未明确。目的探讨活血通络法对激素性股骨头坏死囊性变患者血清骨吸收/成血管/成骨蛋白作用的影响。方法纳入2019年1月—2021年1月在广州中医药大学髋关节研究中心收治的60例SIONFH患者为研究对象,按随机数字表法分成两组,对照组和治疗组各30例。另选取同时期在医院体检正常且无激素使用史30例志愿者作为正常组。治疗组给予活血通络胶囊(2 g/次,3次/d)及碳酸钙(600 mg/次,1次/d)治疗,对照组给予等量碳酸钙治疗,两组患者疗程均为12个月,同时患肢加以限制性负重。采集空腹血清,采用酶联免疫吸附试验检测血清核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、骨保护素(OPG)、钙黏蛋白相关蛋白(CTNNB1)的表达水平,以门诊复诊方式分别于患者出院后第6、12个月进行2次随访,以股骨头塌陷定义为终点事件。以髋关节疼痛视觉模拟评分(VAS)、髋关节功能(Harris)评分和坏死面积评分进行疗效评估。结果3组研究对象基线RANKL、PDGF-BB、OPG、CTNNB1水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05),组间比较结果显示,对照组、治疗组RANKL、PDGF-BB均高于正常组,OPG、CTNNB1均低于正常组(P<0.05)。重复测量方差分析结果示,时间和组别对RANKL、PDGF-BB、VEGFA、OPG、CTNNB1水平存在交互作用(P<0.05),时间和组别对RANKL、PDGF-BB、VEGFA、OPG、CTNNB1水平主效应显著(P<0.05)。其中第6个月治疗组RANKL水平高于对照组,第12个月治疗组PDGF-BB水平高于对照组,第6、12个月VEGFA、OPG、CTNNB1水平高于对照组(P<0.05)。治疗后第12个月治疗组髋关节VAS评分、坏死面积评分低于对照组,髋关节Harris评分高于对照组(P<0.05)。组内比较结果显示,治疗后第12个月治疗组髋关节VAS评分、坏死面积评分低于治疗前,髋关节Harris评分高于治疗前(P<0.05),对照组髋关节VAS评分、髋关节Harris评分高于治疗前(P<0.05)。结论活血通络法能上调激素性股骨头坏死患者RANKL、PDGF-BB、VEGFA、OPG和CTNNB1蛋白表达水平,有效促进SIONFH患者骨修复及改善临床症状,推测该疗法通过“骨吸收/成血管/成骨”三元修复网络促进囊性变骨修复作用。

活血通络胶囊对激素性股骨头坏死大鼠肠道菌群影响的研究

背景激素性股骨头坏死(SONFH)是一种常见且致残性高的疾病,活血通络胶囊已被多次证明在防治股骨头坏死上疗效显著,但是治疗是否通过调节肠道菌群目前少见研究。目的建立SONFH大鼠模型并采用活血通络胶囊进行干预,分析比较各组大鼠肠道菌群的多样性,筛选出SONFH特异性改变的菌属并观察活血通络胶囊对肠道菌群的作用。方法2022年4—10月选取雄性SD大鼠24只,采用随机数字表法分为空白组(n=8)、模型组(n=8)、活血通络组(n=8),建造SONFH模型,活血通络组造模第3~28天给予0.63 g·kg^(-1)·d^(-1)活血通络胶囊灌胃,空白组和模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。药物干预结束后收集大鼠股骨进行HE染色、Micro-CT分析。收集大鼠粪便进行16S rDNA测序。采用α多样性和β多样性分析评估物种组间和组内群落的多样性及差异性,采用线性判别分析(LEfSe)比较三组大鼠肠道菌群差异。采用COG功能预测三组大鼠肠道菌群功能。结果模型组空骨陷窝率高于空白组、活血通络组(P<0.05)。模型组骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)低于空白组,骨小梁分离度(Tb.Sp)高于空白组(P<0.05);活血通络组BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于模型组,Tb.Sp低于模型组(P<0.05)。三组大鼠肠道菌群结构存在差异,与空白组相比,模型组肠道菌群ASV数目增加;与模型组比较,活血通络组肠道菌群ASV数目减少。模型组Shannon指数高于空白组(P<0.05)。β多样性分析主坐标分析(PCoA)图显示,三组样本存在部分重叠,但是能区分三组的群落结构。相似性分析结果显示,组间差异大于组内,差异有统计学意义(R=2062,P=0.01)。LEfSe分析结果显示,与空白组比较,模型组脱硫弧菌(Desulfovibrio)、Hafnia-Obesumbacterium、明串珠菌属(Leuconostoc)、葡萄球菌属(Staphylococcus)丰度升高,拟杆菌属(Bacteroides)、普雷沃氏菌属_UCG-001丰度降低(P<0.05);与模型组比较,活血通络组草酸杆菌属(Oxalobacteraceae)、扭链胃球菌属(Ruminococcus_torques_group)丰度升高,理研菌属(Rekenella)、Kineothrix菌属丰度降低(P<0.05)。三组大鼠COG功能预测结果显示,与空白组比较,模型组菌群COG功能主要集中于碳水化合物运输与代谢、无机离子转运和代谢、氨基酸转运和代谢、脂质转运和代谢、细胞壁/膜/包膜生物发生;与模型组比较,活血通络组功能集中于无机离子转运和代谢、碳水化合物运输与代谢,且复制、重组和修复、转录、细胞周期控制、细胞分裂和染色体分裂、细胞运动功能水平升高。结论SONFH大鼠菌群多样性较正常大鼠增加,增加的菌属主要是致病菌属,而相应有益菌属则出现减少。活血通络胶囊可能通过改变肠道菌群的丰度和多样性以及调控Oxalobacteraceae、Ruminococcus_torques_group等菌属丰度而实现治疗SONFH的目的。

Piezo1在激素性和酒精性股骨头坏死骨组织中的差异表达

背景:据报道,激素、酒精均可抑制骨髓间充质干细胞从而影响骨的形成与修复,而股骨头塌陷的发生与机械应力刺激、坏死组织修复能力相关,推测Piezo1可能是感应股骨头坏死塌陷的力学敏感蛋白。目的:观察力学感应蛋白Piezo1在激素性和酒精性股骨头坏死患者骨组织中的差异表达。方法:选取30例在2020年8月至2021年4月因股骨头坏死行人工全髋关节置换的患者,收集其股骨头标本及临床、影像资料。股骨头标本均为ARCOⅢ期;其中男20例,女10例;分为激素组15例,酒精组15例。苏木精-伊红染色观察股骨头标本骨组织形态结构变化;Westernblot检测骨组织中Piezo1蛋白的半定量表达;免疫组化检测Piezo1蛋白在骨组织中的定位表达。结果与结论:①苏木精-伊红染色结果发现激素及酒精组坏死区骨质结构紊乱、骨髓坏死,均有大量空虚的骨陷窝;②Western blot结果提示激素组患者股骨头骨组织的坏死区、硬化区和正常区Piezo1蛋白的表达均高于酒精组患者(P<0.05);③免疫组化结果提示激素性股骨头坏死组坏死区、硬化区和正常区阳性表达较酒精组更明显;④结果提示,Piezo1可能是感应股骨头坏死塌陷的力学敏感蛋白,并参与成骨的过程;激素性与酒精性股骨头坏死骨组织中Piezo1的差异表达可能与两者不同的骨形成修复特点有关。

激素性股骨头坏死囊性变分布规律及病理特点

背景:股骨头力学承载能力下降是引起股骨头塌陷的主要原因,而囊性变的产生影响了髋关节正常的力学传导途径,但目前很少有文献对股骨头坏死发展过程中二者的关系进行探索。目的:结合热力图模型和激素性股骨头坏死病理结果探讨激素性股骨头坏死囊性变的分布规律及病理特点。方法:以2021年6-12月于广州中医药大学第三附属医院被诊断为激素性股骨头坏死的30例(30髋)患者为研究对象,提取激素性股骨头坏死囊性变轮廓线,将轮廓线匹配至标准股骨头模型上,对轮廓线进行热图呈现;统计股骨头坏死位置与坏死面积,研究二者之间的关系;苏木精-伊红染色观察股骨头标本骨组织形态结构变化。结果与结论:①通过构建激素性股骨头坏死囊性变热力图及结合股骨头病理结果发现,激素性股骨头坏死囊性变好发于股骨头中外侧柱,相较于内侧柱囊性变的面积而言,外侧柱囊性变面积最大,且随着囊性变发生位置的内移,其面积也会随着减小;②并且囊性变周围散在分布微小骨折线,它可能是影响股骨头力学承载能力和头内稳定性的重要因素之一。

基于“蓄毒致毒”探讨痛风性关节炎的态靶治毒思路

痛风性关节炎是与高尿酸血症密切相关的一种反复炎症性疾病,专家团队在长期临证学习及总结古人经验的基础上,认为痛风性关节炎因湿、热相搏,郁而不解,热极成毒,蓄毒于内,阳动生风,助热毒攻注骨节而发病,疾病发展演变历经“蓄毒而发,毒损骨络——湿滞难去,毒伏骨脉”过程。近年研究发现尿酸钠晶体刺激体内炎性体的激活和肠道菌群失调是痛风性关节发生的重要机制,其中炎性体激活可促进机体分泌白介素1β、肿瘤坏死因子-α等加重炎症过程,并且肠菌失调还会导致尿酸的分解、排泄减少。团队认为治疗痛风性关节炎疾病可借鉴仝小林院士的“态靶结合”辨治方略,对痛风辨毒识态定其靶,热毒为痛风急性期所处之“态”,湿毒为痛风缓解期所处之“态”,炎性体、肠菌失调为痛风治疗的重要靶点;治疗上遵循“解毒—化毒”原则,急性期以清热解毒定风为法,缓解期以除湿化毒通络为法。结合态靶辨治方略,分期辨态治毒打靶,减低疾病发病率和复发率,为治疗痛风性关节炎提供理论依据及方法。

基于“虚气留滞”探讨膝骨关节炎低度炎症环境的病机及中药治疗进展

膝骨关节炎(KOA)可致膝关节呈现广泛的低度炎症,中医药可改善其炎症环境,减缓KOA的发展。中医的“虚气留滞”理论与KOA低度炎症环境相契合,可认为是KOA低度炎症的基本病机,其中虚气失荣、肝肾亏虚、气血失养为KOA发病之本,留滞不通、寒湿(湿热)瘀阻、邪瘀留滞为发病之标,故临证时应注意补虚通滞、扶正祛邪、补肾活血。而中药多具有补益肝肾气血、活血化瘀、祛风寒湿功效,可通过下调白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α等炎症因子,改善低度炎症环境,恢复关节功能。故未来应高度关注KOA潜在的低度炎症环境,全面、深刻地理解其病理机制,并进一步挖掘中药治疗的具体机制。

肾-脑-肠-骨轴及其在骨伤科疾病防治中的应用

中医学认为人体是一个有机的整体,人体脏腑器官具有密切联系,任何一个脏腑器官的疾病都不是独立存在的,它可以受其他器官影响而发病或发病后进一步导致其他器官功能障碍。肾、脑、肠、骨之间联系紧密,四者之间存在关系轴。为进一步了解肾-脑-肠-骨轴,为临床防治骨伤科疾病提供新的思路与理论依据,本文从肾骨相关、肾脑相关、脑骨相关、肾肠相关、脑肠相关、肠骨相关几个方面对肾-脑-肠-骨轴进行了详细阐述,并对其在骨质疏松症、膝骨关节炎、股骨头坏死等骨伤科疾病防治中的应用进行了探讨。

活血通络胶囊促进骨髓间充质干细胞成骨中的ERα-Wnt/β-catenin信号通路

背景:活血通络胶囊在临床上可预防无症状股骨头坏死的进展,但其相关机制尚不明确。目的:探讨活血通络胶囊对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及ERα-Wnt/β-catenin通路的作用。方法:将第3代人骨髓间充质干细胞加入含不同质量浓度活血通络胶囊(0,1,5,10 mg/L)的成骨诱导基培养14 d,采用茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测确定活血通络胶囊促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的最佳质量浓度。然后将第3代人骨髓间充质干细胞进一步分成4组:对照组、活血通络胶囊组、活血通络胶囊+ICI 182780组、活血通络胶囊+ICI 182780+DKK1组,采用qRT-PCR、Western blot及免疫荧光染色等方法观察活血通络胶囊、雌激素受体抑制剂ICI 182780和重组人DKK1蛋白对人骨髓间充质干细胞成骨的影响。结果与结论:①活血通络胶囊(10 mg/L)能显著促进人骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化,并促进成骨基因Runx2、OPN、DLX5、BGLAP和ERα的mRNA表达,以及Wnt/β-catenin通路相关靶点β-catenin、TCF7、Lef1、C-MYC、CYCLIN D和C-JUN的mRNA表达;②活血通络胶囊的成骨作用受到ERα抑制剂ICI 182780和Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK1的抑制;③结果表明,ERα-Wnt/β-catenin信号通路参与了活血通络胶囊对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的促进作用。

基于肠道菌群-肠-脑轴探讨肾虚型骨骼疾病的发病机制

骨骼疾病严重影响患者健康及生活质量。越来越多研究发现肠道菌群与肾虚型骨骼疾病关系密切,肠道菌群-肠-脑轴可能是多种肾虚型骨骼疾病发生发展过程中的关键环节。笔者全面总结了肠道菌群在骨质疏松症、膝骨关节炎、股骨头坏死等多种肾虚型骨骼疾病发病机制中的作用,对肠道菌群-肠-脑轴从短链脂肪酸、血清素、炎症细胞及相关免疫因子等方面调控肾虚型骨骼疾病的作用机制进行了综述,以期为肾虚型骨骼疾病的诊断与治疗提供新思路。

膝骨关节炎内翻畸形与胫骨平台下低密度影面积的关联

目的基于热力图分析膝骨关节炎(KOA)患者的内翻畸形与胫骨平台下低密度影面积的关联性。方法回顾性分析2020年6月至2021年4月广州中医药大学第三附属医院诊断为KOA的患者406例(594膝)的影像学及临床资料。纳入标准:符合KOA影像学和临床表现诊断标准;年龄≥50岁;影像学检查显示力线正常或者膝内翻畸形。排除标准:膝外翻畸形;影像学资料不全;过去半年内曾服用过影响骨代谢药物的患者;因关节外畸形而影响膝关节下肢负重力线者。根据患者负重位下肢全长片测量下肢负重力线,并根据下肢负重力线将患者分为三组:力线正常组(力线位于胫骨髁间嵴)、轻度内翻组(力线位于胫骨内侧平台)和重度内翻组(力线超出胫骨内侧平台)。收集记录患者年龄、身体质量指数(BMI)等指标。将患者的膝关节负重正位片导入E-3D软件,提取胫骨平台下低密度影的轮廓线,通过Image-Pro Plus 6.0软件测量轮廓线内的面积。轮廓线匹配至标准膝关节模型上,采用单因素方差分析比较3组患者年龄、BMI、胫骨平台下低密度影的位置及面积。结果406例(594膝)患者中男12例(16膝),女394例(578膝),双膝188例,单膝218例;平均年龄(69±8)岁。所有患者均完成测量分析,其中力线正常组66膝,轻度内翻组351膝,重度内翻组177膝。三组患者年龄和BMI差异无统计学意义(均为P>0.05)。比较3组热力图发现,力线正常组的胫骨平台下低密度影位于胫骨平台下正中,其低密度影范围最小;重度内翻组较力线正常组、轻度内翻组两组的低密度影位置最接近胫骨内侧皮质骨,且范围最大。力线正常组的平均面积为(6568±519)mm^(2),轻度内翻组平均面积为(7266±577)mm^(2),重度内翻组平均面积为(8240±485)mm^(2),三组对比差异有统计学意义(F=293.140,P<0.001)。结论胫骨平台下低密度影面积是影响膝骨关节炎患者内翻畸形严重程度的重要危险因素。胫骨平台下低密度影面积与膝骨关节炎患者的内翻畸形严重程度呈正相关。