C-反应蛋白和超敏C-反应蛋白检测结果的比对分析

目的:探讨C-反应蛋白(CRP)和超敏C-反应蛋白(hs-CRP)检测结果的可比性。方法 :依据EP9-A2文件进行方法间的比对分析,并检测两种测量方法的功能灵敏度。结果:PPI仪器的CRP和BNII仪器的hs-CRP检测结果的线性回归方程为:y=0.91x+0.146,R2=0.998。样品浓度为0.1 mg/L时,两台仪器的重复性试验CV值均小于20%。结论:PPI仪器的CRP与BNII的hs-CRP检测结果可比,灵敏度性能相当。

质谱技术及其在临床检验中的应用

质谱（mass spectrometry，MS）技术是一种重要的检测分析技术，通过将待测样本转换成高速运动的离子，根据不同的离子拥有不同的质荷比（m／z）进行分离和检测目标离子或片段，然后依据保留时间和其丰度值进行定性和定量。

8个临床检测系统检测α-淀粉酶与参考测量程序的比对分析

目的观察不同临床检测系统与参考测量程序测定α-淀粉酶(Amy)的可比性。方法根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)EP9-A2文件,用8个临床检测系统与参考测量程序分别测定患者血清、国际和国内实验室间比对样本、商用校准品及质控品的Amy活性水平,并进行比对。以卫生部临床检验中心室间质评Amy允许总误差的1/2为标准,评价临床检测系统检测血清Amy结果的临床可接受性。结果 8个临床检测系统(依次编号为Y1～Y8)与参考测量程序(X)测定血清样本的相关性方程分别为Y1=0.934 7X-2.375 0、Y2=0.801 6X+13.901 4、Y3=1.139 7X+13.979 5、Y4=0.829 3X+0.702 4、Y5=0.830 6X+5.826 9、Y6=0.791 0X+12.195 8、Y7=0.728 4X-0.826 5、Y8=0.721 9X+44.318 0。其中,Y1、Y2、Y5、Y6系统检测患者血清Amy结果为临床可接受,而Y4、Y7系统经参考测量程序赋值新鲜血清校准后检测结果为临床可接受。结论用参考测量程序赋值的新鲜血清对临床检测系统进行校准可提高不同检测系统间检测Amy的可比性;建立参考测量程序是保证不同检测系统间Amy检测结果可比性的关键。

影响α-淀粉酶参考方法准确测量因素的探讨

目的 通过对影响α-淀粉酶参考方法测量准确性的主要因素进行探讨,以帮助参考实验室更好地建立和运行该参考方法.方法 在其他因素不变的条件下,只改变实验中的一个因素,检测2009A,2009B（指2009年RELA样本,下同）各10次,计算其与原方法检测结果的相对偏倚及统计学意义（允许偏倚范围设定为参考方法等效限的1/4,即±1.25%）.主要探讨的影响因素有：a.反应液和样本加入步骤：a1.反应液和样本分步加入;a2.反应液和样本同时加入.b.加样方式：b1.手工加样,加样前润洗移液器,加样后不洗;b2.手工加样,加样前、后均不润洗移液器;b3.手工加样,加样前不洗,加样后回洗移液器;b4.稀释配液仪加样.c.混匀方式：c1.反应全程不搅拌;c2.搅拌至反应延迟时间（delay time）的2/3时停止;c3.反应全程搅拌.d.α-葡萄糖苷酶浓度：反应液中溶液2和α-葡萄糖苷酶（活性为1 014 ku/L）的比例为d1 100：1,d2 100：0.5,d3 100：0.8和d4 100：1.2.e.调节起始试剂pH方式：e1.静止条件下达到方法要求;e2.搅拌条件下达到方法要求.结果 ①a2,b1,c1,d4方法检测样本（2009A,2009B,下同）结果,相对偏倚为-0.44%～0.40%（t=-1.00～4.45,P值均＞0.05,差异均无统计学显著性意义）.②b2,b3和c3方法检测结果的相对偏倚为-2.14%～17.0%（t=-37.21～26.50,P值均＜0.05,差异均有统计学显著性意义）.③d2,d3方法检测两样本结果的相对偏倚为-0.47%～-0.04%（t=1.191～12.92,2009A样本结果P值均＞0.05,差异无统计学显著性意义,2009B样本结果P均＜0.05,差异有统计学显著性意义）.④e2方法检测两样本结果的相对偏倚为-0.48%和0.11%（t=2.523,1.728,2009A样本P值＜0.05,差异有统计学显著性意义,2009B样本P值＞0.05,差异无统计学显著性意义）.结论 通过对实验中常见影响因素的分析,优化了方法步骤,对参考方法的建立和运用具有一定的实用价值.

α-淀粉酶参考方法的建立及其性能评价

目的:建立检测血清α-淀粉酶的参考方法,并对其主要性能进行评价。方法:按照国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)推荐的α-淀粉酶活性测定的参考测量程序建立本实验室的参考方法;根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)系列文件(EP5-A2、EP15-A2、EP6-A)对参考方法的精密度、准确度、线性范围等性能进行评价。结果:建立的α-淀粉酶参考方法的精密度评价A、B2个水平样本变异系数均<1.0%。有证参考物质(IRMM/IFCC-456)均值为546.4U/L,均值与靶值的偏移为0.09%,在允许范围内。α-淀粉酶的最大线性范围为1412.5U/L,高于IFCC公布的最大线性范围(719.8U/L)。结论:α-淀粉酶参考方法已基本建立,精密度、准确度及线性范围等性能指标均符合方法要求,为我国参考实验室网络的建立以及临床应用提供了基础和参考。

国际参考实验室能力验证样品的均匀性评价

目的评价国际参考实验室能力验证样品(RELA-A/B)的均匀性是否满足参考实验室比对的要求。方法参照CNASGL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》,用Roche Modular P800生化分析仪测量2014至2016年连续3年RELA-A/B的14个项目,即丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、L-γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、总蛋白(TP)、总胆红素(T-Bil)、尿素(Urea)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、葡萄糖(Glu)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)。计算测量结果均值()、标准差(s)和变异系数(CV),用单因素方差分析和SS≤0.3σ准则分析评价其瓶间差异。结果 RELA 2014A和2014B样品AST测量结果 CV>2.0%。除RELA 2016B样品CK测量结果 CV<2.0%外,其他样品CK测量结果 CV均>2%。单因素方差分析结果显示,所有样品中CK测量结果 F均>临界值4.39,差异有统计学意义(P<0.05);2015B样品ALT和T-Bil,2014A样品Cr测量结果 F均>临界值4.39,差异有统计学意义(P<0.05);其他测量结果 F均<临界值4.39,差异无统计学意义(P>0.05)。S_S≤0.3σ准则分析结果显示,所有样品CK测量结果 S_S>0.3σ,CK测量结果存在瓶间差异;其他项目测量结果 S_S均≤0.3σ,其他项目测量结果无瓶间差异。结论国际参考实验室能力验证样品CK项目存在瓶间差异,值得注意;其他项目均匀性能满足参考实验室能力验证要求。

不同厂家校准品校准同一检测系统检验结果的实验研究

目的 观察不同厂家的校准品能否直接校准非配套的检测系统.方法 参考美国临床实验室标准化委员会的EP9-A2文件,以罗氏检测系统为目标检测系统（系统1）,用罗氏C-fas、朗道校准品Level2和Level3分别与国内某一厂家生产的生化分析仪器、试剂和检测程序组成待评检测系统（系统2～4）,然后用上述四个检测系统分别检测40份新鲜患者血清中的总胆红素（TBil）等10个项目,每个标本测定两次,结果取均值.计算待评检测系统（Y）与目标检测系统（X）之间的相对偏倚,以美国临床医学检验部门修正法规（CLIA＇88）允许总误差的1/2为标准,判断检验结果的可比性.结果 系统2与系统1的TBil,DBil,ALP和CK具有可比性,其他项目不具有可比性.系统3与系统1的TBil和GGT具有可比性,其他项目不具可比性.系统4与系统1的Glu具有可比性,其他项目不具可比性.结论 不同厂家生产的校准品不能直接用于校准非配套检测系统,每一检测系统都必须具有自己的配套校准品.

高效液相色谱串联质谱法测定血清非结合雌三醇的前处理研究

目的优化高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定血清游离雌三醇(uE3)的前处理方法。方法以活性炭吸附血清为研究基质,通过加入已知量的雌三醇(E3)标准品及E3-2-3-4-13 C3内标,在LC-20AD XR高效液相色谱系统和API 5500串联四级杆质谱仪上对E3检测的色谱条件、质谱条件及萃取条件等进行优化。结果色谱条件:选用菲罗门Knietex色谱柱(100.0mm×2.1mm,2.6μm);有机相为甲醇,水相为0.1mmol/L氟化铵水溶液,8min梯度洗脱。质谱条件:选用电喷雾(ESI)负离子模式和多反应监测(MRM)模式分析,选择质荷比(m/z)287→m/z 145作为E3的定量离子对,m/z 287→m/z 171作为定性监测离子对;选择m/z 290→m/z 148作为内标的定量离子对,m/z 290→m/z 174作为定性监测的离子对。萃取条件:萃取剂为正己烷/乙酸乙酯(50/50,v/v),样品与萃取剂的比例为1∶2,萃取率可达85.71%。结论 E3检测的色谱条件、质谱条件、萃取条件已得到全面优化,为后续建立LC-MS/MS测定人血中uE3的参考方法打下良好基础。

同位素稀释液相色谱串联质谱法测量血清未结合雌三醇的协作研究

目的用同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC/MS/MS)候选参考方法进行实验室间血清未结合雌三醇(u E3)协作研究,通过该研究进一步确认方法的性能特征(正确度和精密度),并将该方法在国内参考实验室推广,推动u E3标准化进程。方法依据ISO/WD 15725-1和GB/T 6379标准,拟定我国血清u E3协作研究方案。协作研究分为两个阶段:初步试验和正式试验,共9家参考实验室参加。按要求收集5个浓度水平样品并进行均匀性评价,分发到9家参考实验室,要求每个样品每日重复测量5次,连续测量3 d。计算各实验室测量结果的偏移和精密度,用格拉布斯(Grubbs)检验和柯克伦(Cochran)检验识别离群值和离群实验室。根据合格实验室的结果计算靶值,并向离群实验室和偏出允许范围的实验室提供整改建议。结果样品均匀性评价:所有样品测量结果计算F值均小于F0.05(9,20)临界值,样品中u E3是均匀的。初步试验:Grubbs检验,1个实验室测量结果为离群值;Cochran检验,2个实验室检验结果为离群值。剔除离群值后计算靶值;2017E301为(22.08±0.24)nmol/L;2017E302为(33.46±1.67)nmol/L。2个实验室结果超出允许范围。正式试验:Grubbs检验,所有实验室测量结果均未检出离群值;Cochran检验,3个实验室数据出现离群值。剔除离群值后计算靶值,2017E303为(10.36±0.35)nmol/L,2017E304为(15.47±0.26)nmol/L,2017E305为(46.97±1.19)nmol/L;各实验室间测量结果不精密度分别为1.14%~2.21%、0.79%~1.93%、0.60%~2.09%,测量结果偏移分别为-6.18%~4.83%、-2.26%~2.39%、-4.19%~4.07%。结论通过组织开展协作研究,确认各参考实验室通过协作研究方案能够快速建立并运行u E3候选参考方法,除个别实验室外各实验室的检测性能满足预定要求(不精密度<3.0%,偏移<7.5%),进一步确认了该方法的性能和各实验室运行参考方法的能力。通过初步研究和正式研究对研究方案的各实验环节进行了验证和完善;推动了u E3项目参考方法在我国参考实验室的运行,为后续厂商试剂主校准品联合定值或标准物质研制搭建了平台,促进u E3项目的标准化。

冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质的研制

目的研制冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质,作为量值传递的标准。方法参照JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》和JJF 1644—2017《临床酶学标准物质的研制》要求进行均匀性、稳定性、互换性评价;联合6家通过中国合格评定国家认可委员会(CNAS)认可的校准实验室对标准物质进行定值,评定其均匀性、稳定性和定值引入的不确定度,计算扩展不确定度。结果标准物质均匀性和稳定性均良好,互通性评价结果显示,4个常规检测系统的测量值均位于95%可信区间内。定值结果:水平1为(106.3±4.3)U/L(k=2),水平2为(268.1±7.9)U/L(k=2)。结论研制的冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质标示值可靠,均匀性、稳定性较好,具有互换性。

血小板计数参考方法的性能评价及临床应用

目的复现血小板计数的参考方法并应用于临床。方法根据国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的流式细胞术计数血小板的参考方法,在本实验室复现该参考方法;通过2家校准实验室赋值新鲜全血,对4台不同型号血液分析仪的血小板计数结果进行正确度验证,并对结果不满意的仪器进行校准。结果血小板计数参考方法检测高、中、低值标本PLT的不精密度(CV)分别为2.2%、2.0%、8.4%,PLT在21×109/L^794×109/L范围内线性良好(r2=0.998),标本在6 h内测定结果稳定,携带污染率为0.05%,正确度偏倚小于3%。正确度验证中,Mindray BC 6800、Sysmex XE-5000i和Sysmex XT 1800i血液分析仪细胞检测结果均在可接受限内,Sysmex XS 500i血液分析仪经校准后通过验证。结论复现了ICSH推荐的血小板计数参考方法,其性能符合要求;赋值新鲜全血用于临床血液分析仪的正确度验证具有可行性,且可用于仪器的校准。

探讨酶学参考方法在室间质评中的应用

目的探讨酶学参考方法应用于卫生部临床检验中心常规化学室间质评中的可行性。方法选取5个临床常规检测系统和参考方法同时检测临床检验中心2012年第1次室间质评样本和患者血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、α-淀粉酶(AMY),将各临床常规系统检测结果与参考方法测量结果或临床检验中心靶值进行比较,计算相对偏倚。以临床检验中心室间质评允许误差的要求为标准,判断各系统各项目是否合格。结果参考方法测量质评样本结果与临床检验中心靶值的相对偏倚在±10%以内。用临床检验中心的允许总误差作为判断标准,以参考方法检测结果为参比,湿化学系统室间质评样本和患者血清合格率为100.0%;干化学系统室间质评样本和患者血清合格率分别为77.1%和97.1%。用临床检验中心酶学正确度验证的标准评价室间质评样本测量结果,以参考方法检测结果为参比,湿化学系统所有测量结果合格率分别为72.9%和63.6%。结论参考方法可以应用于室间质评,对解决临床检验结果的正确性提供了重要依据。

总蛋白改良参考方法的建立及其用于临床检测结果的溯源性研究

目的建立测量总蛋白(TP)参考方法,评价不同实验室TP测定结果的溯源性。方法参照美国疾病控制与预防中心推荐的参考方法及相关文件,建立37℃温浴10min的总蛋白参考方法。根据美国临床实验室标准化协会系列文件对方法的精密度、正确度、线性范围等性能进行评价。应用该参考方法对新鲜血清进行赋值作为校准品校准广州21家实验室,比较校准前、后赋值血清校准品、血清样本测定结果间的偏移,进行检验结果的可比性评价。结果改良参考方法的精密度评价样本浓度为55.48、88.68g/L的CV分别为0.56%、1.23%,标准参考物质909C与靶值的偏移为1.76%,分析测量范围上限128.69g/L。与参考方法测量结果比较,赋值血清校准品校准前平均偏移为6.38%,校准后降为1.86%,样本血清1、2校准前偏移分别为6.04%和8.71%,校准后降为-1.61%、-0.13%。结论改良的双缩脲法测量TP方法性能好,应用参考方法对新鲜血清进行赋值能够实现不同检测系统结果的溯源性。

腺苷脱氨酶三种原核表达载体的构建及蛋白表达

目的利用分子克隆技术表达腺苷脱氨酶蛋白。方法从人白细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,再以其为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增腺苷脱氨酶基因,然后将目的基因连接到3种原核质粒pET-28b、pET-32a(+)和pHSIE中,再将测序完全正确的克隆质粒用CaCl2法转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达,并筛选最优表达条件,经Western-blot和SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。结果 3种质粒载体携带的目的基因DNA测序结果证实其很好地连接入载体质粒,表达的ADA蛋白经Western-blot和SDSPAGE鉴定符合,最优表达条件为诱导剂IPTG浓度0.4mmol/L,表达温度为16℃,表达时间为24h。结论该实验成功构建了腺苷脱氨酶的3个原核载体(BL21+pET-28b+ADA,BL21+pET-32a+ADA,BL21+pHSIE+ADA),且3个载体均成功高效表达了腺苷脱氨酶蛋白。

雷公藤内酯醇衍生物对肝癌细胞增殖、凋亡的作用研究

目的研究新型雷公藤内酯醇(Triptolide,TPL)衍生物对正常肝细胞的毒性以及对肝癌细胞的增殖、凋亡作用。方法通过对TPL进行化学修饰,获得2种新型衍生物:雷公藤内酯三醇(TP-3-OH)和丙烯酸雷公藤甲素酯(TPO)。通过体外培养人胚胎肝细胞LO2和肝癌细胞Hep G2、Hep3B、SMMC-7721,分为DMSO对照组,TPL/TP-3-OH/TPO低、中、高浓度组(25、50、100 nmol·L^(-1))。通过检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的活性来评价TP-3-OH、TPO对肝细胞的毒性;采用MTT实验检测细胞增殖情况;采用流式细胞术及Western Blot法检测细胞凋亡及凋亡通路相关蛋白表达情况;采用划痕实验检测细胞迁移能力。结果与TPL组比较,50、100 nmol·L^(-1)浓度条件下TP-3-OH、TPO组的LO2细胞培养上清中的LDH活性明显降低(P<0.05,P<0.01)。与DMSO对照组比较,TPO中、高浓度(50、100 nmol·L^(-1))组的LO2细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05,P<0.01),TPO低、中、高浓度(25、50、100 nmol·L^(-1))组的Hep G2、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞增殖抑制率均明显升高(P<0.05,P<0.01);TPO高浓度(100 nmol·L^(-1))组的LO2、Hep G2和SMMC-7721细胞的早期、晚期细胞凋亡率均明显升高(P<0.05,P<0.01);TPO中、高浓度(50、100 nmol·L^(-1))组SMMC-7721、Hep G2细胞的cleaved-Caspase-3、cleaved-PARP蛋白表达显著上调(P<0.01);TPO中浓度(50 nmol·L^(-1))组SMMC-7721细胞的24 h迁移率明显降低(P<0.05)。结论经化学修饰获得的2种新型TPL衍生物对肝细胞的毒性降低,其中TPO具有抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡的作用。

pET32a-PTEN融合质粒的构建与表达

目的:构建PTEN原核融合质粒,利用原核表达体系表达PTEN蛋白。方法:从人新鲜外周血中提取总RNA,采用逆转录和聚合酶链反应等分子生物学技术扩增PTEN编码区基因,并将其pET32a质粒融合,化学法转化大肠杆菌DH5α进行克隆。将鉴定正确的pET32a-PTEN融合质粒转化入表达菌株BL21,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其蛋白表达,SDS-PAGE和Western-Blot鉴定蛋白表达情况。结果:菌落PCR及DNA测序证实目的基因与质粒完整融合;融合质粒成功转入表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE和Western-Blot结果显示表达菌经IPTG诱导后表达出73 kDa左右的蛋白。结论:成功构建融合质粒,并且PTEN全长蛋白在原核表达菌BL21中完整、高效表达。

慢性肾脏病3~5期红细胞参数特征分析

目的:分析广东省中医院总院住院单纯慢性肾脏病(CKD)3~5期病人的红细胞参数,探讨CKD病人红细胞参数的特征及其临床应用价值。方法:收集CKD 3~5期各期病人各120例,使用Sysmex XE-5000型全自动血细胞分析仪及配套试剂检测所有研究对象红细胞计数(RBC)、血细胞比容(HCT)、血红蛋白(Hb)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白(MCH)水平、红细胞平均血红蛋白(MCHC)水平、红细胞分布宽度(RDW),并对参数结果进行统计分析。结果:同一病程不同性别以及同一性别不同病程的各组病人年龄差异均无统计学意义(P>0.05);在不考虑性别时,不同病程病人的年龄差异有统计学意义(P<0.05)。男性的MCHC数量在各期均高于女性(P<0.05~P<0.01);男性RBC、Hb、HCT数量在CKD 3期、4期均高于女性(P<0.01),在5期差异无统计学意义(P>0.05);RDW在CKD3期、4期的差异无统计学意义(P>0.05),在5期男性高于女性(P<0.05);MCV、MCH在各期的性别差异均无统计学意义(P>0.05)。男、女性病人的RBC、Hb和HCT数量均随着分期的升高呈减少趋势(P<0.01),而RDW呈增加趋势(P<0.01);MCV和MCH数量在女性病人中随着分期的升高呈减少趋势(P<0.01),在男性病人中各期之间差异无统计学意义(P>0.05);男、女性的MCHC数量在各期间的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:RBC、Hb、HCT水平变化与CKD的发展密切相关,根据红细胞参数特征建立的红细胞参数范围可为临床医生评估CKD 3~5期病人的病情提供参考。

pET32a-AKT1重组质粒的构建与表达

目的构建重组质粒pET32a-AKT1,利用原核表达体系表达AKT1蛋白。方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增AKT1编码区基因,并将其与pET32a质粒融合,并转化大肠埃希菌DH5α及原核菌株BL21(DE3),采用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot进行蛋白鉴定。结果目的基因与质粒完整融合;重组质粒pET32a-AKT1成功转入菌株DE3;IPTG诱导后,DE3表达相对分子质量为70 000的蛋白。结论成功构建重组质粒pET32a-AKT1,且AKT1蛋白在原核表达菌DE3中完整、高效表达。

单纯形法在腺苷脱氨酶反应条件优化中的运用

目的探讨单纯形优化方法在腺苷脱氨酶最佳反应条件选择中的作用。方法运用单纯形优化法对腺苷脱氨酶最佳反应条件进行筛选,参考相关文献确定初始单纯形,根据各种组合条件下得到的测定结果进行单纯形的移动与终止,从而得到最佳反应条件。结果 8种影响因素组成的单纯形进行了24次移动得到33种反应条件的组合。腺苷脱氨酶样本在第28种组合条件下得到的测定结果最高,该反应条件即为最优条件,该条件下测定活性比目前推荐的测定方法提高近1倍。结论单纯形法是寻找临床酶学测定最优反应条件的一种简单有效的方法。

血清雌激素检测方法与标准化进展

人体生理性雌激素在血清中的含量很低,但对建立和维持女性第二性征、妊娠等有着不可替代的重要作用。雌激素水平的测定是临床了解女性内分泌功能和诊断内分泌失调相关疾病的重要手段。随着分析技术的不断发展,雌激素在医学实验室的检测方法从放射免疫法,到酶免疫法,化学发光法,发展为气相色谱串联质谱法和液相色谱串联质谱法,这些技术在雌激素检测、相关疾病监测和预后判断等方面发挥了重要作用。