化浊解毒活血通络方通过调控核因子E2相关因子2/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1通路发挥对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织抗氧化作用的机制研究

目的 观察化浊解毒活血通络方通过调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)通路对脑缺血再灌注损伤大鼠的抗氧化作用,探讨其可能的神经保护机制。方法 将80只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组,每组16只。除假手术组外,其余组采用Longa法制备大脑中动脉闭塞模型大鼠。造模成功后,化浊解毒活血通络方高、低剂量组给分别予化浊解毒活血通络方25、6.25 g/(kg·d)灌胃,尼莫地平组予尼莫地平混悬液9.375 mg/(kg·d)灌胃,模型组及假手术组均予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃。灌胃3 d后比较各组大鼠改良神经功能缺损评分(mNSS),评分后处死取脑,2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色比较各组大鼠脑梗死体积;制作苏木精-伊红(HE)染色切片观察脑组织病理变化;干湿法测量脑组织含水量;检测脑组织丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性;蛋白免疫印迹法检测脑组织Nrf2、Keap1蛋白表达量;逆转录聚合酶链式反应检测脑组织Nrf2、Keap1基因表达。结果 与假手术组比较,模型组、尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组mNSS均升高(P<0.05);与模型组比较,尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组mNSS均降低(P<0.05);与尼莫地平组比较,化浊解毒活血通络方高、低剂量组mNSS均升高(P<0.05);与化浊解毒活血通络方高剂量组比较,化浊解毒活血通络方低剂量组mNSS升高(P<0.05)。假手术未见明显脑梗死灶,其余组脑组织均见白色梗死灶。与假手术组比较,模型组、尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组脑梗死体积均升高(P<0.05);与模型组比较,尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组脑梗死体积均降低(P<0.05);与尼莫地平组比较,化浊解毒活血通络方高、低剂量组脑梗死体积均升高(P<0.05);与化浊解毒活血通络方高剂量组比较,化浊解毒活血通络方低剂量组脑梗死体积升高(P<0.05)。光镜下可见假手术组大鼠脑组织神经元细胞密集,排列整齐,胞浆丰富,染色均匀,胞核居中,核仁清楚,未见明显异常;模型组缺血区脑组织神经元细胞排列紊乱,水肿明显,胞浆染色变淡,出现核固缩、碎裂、溶解现象。与模型组比较,尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组缺血坏死区有所减少,细胞排列紊乱、水肿、胞浆淡染色变淡、细胞核固缩、碎裂、溶解现象均有减轻。尼莫地平组、化浊解毒活血通络方高剂量组缺血坏死区减少更为明显。与假手术组比较,模型组、尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组脑组织含水量均升高(P<0.05);与模型组比较,尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组脑组织含水量均降低(P<0.05);与尼莫地平组比较,化浊解毒活血通络方低剂量组脑组织含水量均升高(P<0.05);与化浊解毒活血通络方高剂量组比较,化浊解毒活血通络方低剂量组脑组织含水量升高(P<0.05)。尼莫地平组与化浊解毒活血通络方高剂量组脑组织含水量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较,模型组、尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组脑组织MDA含量均升高(P<0.05),SOD、CAT活性均降低(P<0.05);与模型组比较,尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组脑组织MDA含量均降低(P<0.05),SOD、CAT活性均增高(P<0.05);与尼莫地平组比较,化浊解毒活血通络方低剂量组脑组织MDA含量升高(P<0.05),SOD、CAT活性降低(P<0.05);与化浊解毒活血通络方高剂量组比较,化浊解毒活血通络方低剂量组脑组织MDA含量升高(P<0.05),SOD、CAT活性降低(P<0.05)。尼莫地平组与化浊解毒活血通络方高剂量组脑组织MDA含量及SOD、CAT活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较,模型组、尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组脑组织Nrf2蛋白表达水平及mRNA表达水平均降低(P<0.05),Keap1蛋白表达水平及mRNA表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,尼莫地平组及化浊解毒活血通络方高、低剂量组脑组织Nrf2蛋白表达水平及mRNA表达水平均升高(P<0.05),Keap1蛋白表达水平及mRNA表达水平均降低(P<0.05);与尼莫地平组比较,化浊解毒活血通络方低剂量组脑组织Nrf2蛋白表达水平及mRNA表达水平均降低(P<0.05),Keap1蛋白表达水平及mRNA表达水平均升高(P<0.05);与化浊解毒活血通络方高剂量组比较,化浊解毒活血通络方低剂量组脑组织Nrf2蛋白表达水平及mRNA表达水平均降低(P<0.05),Keap1蛋白表达水平及mRNA表达水平均升高(P<0.05)。尼莫地平组与化浊解毒活血通络方高剂量组脑组织Nrf2、Keap1的蛋白表达水平及mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 化浊解毒活血通络方具有减轻脑缺血再灌注损伤的作用,其作用机制可能与其通过调控Nrf2/Keap1通路减轻氧化应激反应对机体的损伤作用有关。

化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠LPS及TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的:观察化浊解毒活血通络方对大鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)的保护作用及对LPS及TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法:60只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(MCAO)、化浊解毒活血通络方低(TCM-L)、中(TCM-M)、高(TCM-H)剂量组,每组12只。Longa法结合既往研究经验制备永久性大脑中动脉梗塞大鼠模型。化浊解毒活血通络方低、中、高剂量组大鼠灌胃给予6.25、12.5、25 g/kg化浊解毒活血通络方,假手术与模型组灌胃给予2 ml生理盐水,给药后72 h检测大鼠神经功能缺失情况;HE染色观察脑、肠组织病理改变;TUNEL检测脑组织凋亡;TTC染色观察脑梗死面积;鲎试剂检测血清LPS浓度;ELISA检测血清DAO、脑组织IL-1β、TNF-α表达;Western blot检测脑组织TLR4、NF-κB、肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达;RT-PCR检测脑组织MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA表达。结果:与假手术组相比,模型组大鼠神经功能缺失加重,脑梗死面积增大,脑组织细胞凋亡增加,血清DAO、脑组织IL-1β、TNF-α表达升高(P<0.05),血清LPS表达升高(P<0.05),肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达降低,脑组织TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK、TRAF6蛋白及mRNA表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,化浊解毒活血通络方各组大鼠神经功能缺失减轻,脑梗死面积减小,脑组织细胞凋亡减少,血清DAO、脑组织IL-1β、TNF-α表达降低(P<0.05),血清LPS表达降低(P<0.05),肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达升高,脑组织TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK、TRAF6蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.05),TCM-H组最为显著,血清LPS表达下降(P<0.05)。结论:化浊解毒活血通络方可改善CIRI,其机制可能与降低LPS含量、保护肠道屏障、调控TLR4/NF-κB信号通路减轻炎症反应有关。

田军彪主任中医师从脾论治帕金森病经验分析

帕金森病是神经内科常见疾病,严重影响患者的生活及工作,田军彪主任中医师认为其发生发展与脾密切相关,脾于五脏位置居中,为气血生化之源,同时与其他四脏在功能上关系密切,在治疗上,以脾为中心,同时兼顾四脏,获得良好的临床疗效。

化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠大脑水通道蛋白的影响

目的观察化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠脑水肿的治疗作用,并探索其改善脑水肿是否与调节水通道蛋白(aquaporin,AQP)的变化有关。方法选择健康清洁级成年雄性SD大鼠,采用随机数字表法随机分为假手术组和模型组。假手术组只将线栓插入10 mm即拔出。模型组采用大脑中动脉栓塞再灌注法造模。造模成功后再次随机分为模型组、化浊解毒活血通络方高剂量组、化浊解毒活血通络方低剂量组和尼莫地平组。化浊解毒活血通络方高剂量组和低剂量组于造模后连续3天分别给25 g/(kg·d)、6.25 g/(kg·d)灌胃,尼莫地平组于造模后连续3天给10 g/(kg·d)灌胃,模型组及假手术组连续3天接受等剂量生理盐水。大鼠脑缺血再灌注3天后解剖取材,采用改良神经功能缺损评分对大鼠进行神经功能评估;苏木精—伊红染色观察脑组织病理改变;TTC染色观察脑梗死体积;测干湿重比检测脑水肿;用蛋白免疫印迹法检测AQP-4、AQP-9蛋白的表达;逆转录聚合酶链式反应检测AQP-4、AQP-9mRNA表达。结果(1)与假手术组相比,模型组神经功能评分显著升高(P<0.01),病变侧脑组织变性坏死程度显著升高(P<0.05),脑梗死面积显著升高(P<0.05),脑组织含水量显著升高(P<0.05),脑组织AQP-4、AQP-9mRNA表达明显升高(P<0.05),脑组织AQP-4、AQP-9蛋白表达明显升高(P<0.05)。(2)与模型组相比,中药各组和尼莫地平组神经功能评分显著降低(P<0.05),中药各组和尼莫地平组病变侧脑组织变性坏死程度显著降低(P<0.05),中药各组和尼莫地平组脑梗死面积显著减小(P<0.05),中药各组和尼莫地平组脑组织含水量显著降低(P<0.05),中药各组和尼莫地平组脑组织AQP-4、AQP-9mRNA表达明显降低(P<0.05),中药各组和尼莫地平组脑组织AQP-4、AQP-9蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论化浊解毒活血通络方能显著改善脑水肿,其作用机制可能与抑制AQP4、AQP9的表达有关。

化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的影响

目的:研究化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及对线粒体自噬相关蛋白PTEN诱导激酶1(PINK1)、Parkin的影响。方法:将48只雄性SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药组(化浊解毒活血通络方)、抑制剂组[3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制剂],每组12只。按照Longa法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠模型,造模成功给药3 d后,行大鼠神经功能缺损评分,HE染色观察脑组织病理改变,TTC染色观察脑梗死体积,Western Blot检测脑组织PINK1、Parkin蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测脑组织中PINK1、Parkin mRNA的表达。结果:与假手术组比较,模型组神经功能缺损评分和脑梗死体积显著增加(P<0.05),病理损伤加重,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,中药组大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积显著减少(P<0.05),病理损伤减轻,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与模型组及中药组比较,抑制剂组大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积显著增加(P<0.05),病理损伤加重,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。结论:化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠具有脑保护作用,其机制可能与上调线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin的表达相关。

基于JNK信号通路调控细胞自噬探讨化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究化浊解毒活血通络方通过c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路调控神经细胞自噬减轻脑缺再灌注损伤的作用机制。方法:60只SD大鼠随机分为假手术组、大脑中动脉阻塞/再灌注(MCAO/R)组(模型组)、化浊解毒活血通络方(中药)组(25.0 g·kg^(-1))、JNK抑制剂SP600125(SP)组(5 mg·kg^(-1))、中药+SP组和JNK激动剂Anisomycin(Ani)组(15 mg·kg^(-1))6组。造模24 h后中药组和中药+SP组给予中药汤剂灌胃,连续给药3 d,其余各组灌胃等容积蒸馏水。神经功能评分评估神经功能缺损程度,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色确定脑梗死体积;苏木素-伊红(HE)染色观察脑组织结构变化;尼氏染色检测神经元损伤;原位末端标记法(TUNEL)观察细胞凋亡;透射电镜观察自噬小体超微结构;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测脑组织中微管相关蛋白1轻链3A/B(LC3A/B)、自噬相关基因5(Atg5)、自噬关键分子酵母Atg6同系物1(Beclin1)、p62、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、JNK、磷酸化(p)-JNK和c-Jun的蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组大鼠脑组织中LC3A/B、Beclin1、p62、Atg5、Bcl-2、JNK、c-Jun mRNA表达量。结果:与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高(P<0.05),脑组织梗死体积明显变大(P<0.05),海马区及其周围脑组织形成典型梗死表现,皮层有大量神经元细胞变性、坏死、液化、固缩和深染,有炎性细胞浸润,电镜下可见炎症细胞浸润,线粒体、溶酶体、自噬体和自噬溶酶体严重肿胀。细胞凋亡情况较重,TUNEL阳性细胞明显增加(P<0.05),脑组织内神经元核膜和核仁模糊,突起不连续,胞质尼氏体色浅且数量减少。Western blot结果显示大鼠脑组织LC3A/B、Beclin1、Atg5、JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达明显升高(P<0.05),p62和Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),Real-time PCR结果显示LC3A/B、Beclin1、Atg5、JNK、c-Jun mRNA表达明显增加(P<0.05),p62、Bcl-2 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与模型组比较,中药组、SP组与中药+SP组大鼠神经功能缺损评分均明显降低(P<0.05),梗死体积明显缩小(P<0.05),脑组织病理状态均有所改善,尤以中药组改善明显;线粒体M嵴丰富,基本正常,内质网轻度扩张,高尔基体轻度肿胀,细胞核核膜轻度融合,溶酶体、自噬小体、自噬溶酶体可见,但数量较少,TUNEL阳性细胞明显减少(P<0.05),凋亡情况有所减轻,尤以中药组最为显著,脑组织神经元核仁、核膜可辨,胞浆尼氏体有一定程度的脱失,但较模型组明显减轻。Western blot结果显示中药组、SP组与中药+SP组LC3A/B、Beclin1、Atg5、JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达明显降低(P<0.05),中药组和SP组p62蛋白表达明显升高(P<0.05),中药组和中药+SP组Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。Real-time PCR显示中药组、SP组和中药+SP组大鼠脑组织LC3A、LC3B、Beclin1、Atg5、JNK、c-Jun mRNA表达明显降低(P<0.05),p62 mRNA表达明显增加(P<0.05);中药组和中药+SP组Bcl-2 mRNA表达明显增加(P<0.05)。Ani组评分明显升高(P<0.05),梗死体积显著增加,神经元细胞坏死情况加重,炎性浸润明显,神经元核膜融合、异型凸起,异染色质增加,边缘聚集,线粒体肿胀严重,内质网扩张,溶酶体增加,胞浆内囊泡增多,可见自噬体和自溶酶体,TUNEL阳性细胞增加(P<0.05),凋亡情况较重,尼氏小体数量明显减少,脱失较重,着色浅,核仁核膜模糊;Ani组Atg5、c-Jun、JNK mRNA表达增加(P<0.05),Beclin1、p62、Bcl-2 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与中药组和SP组比较,Ani组LC3A/B、Beclin1、Atg5、JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达明显升高(P<0.05),p62、Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)。与中药组比较,SP组和中药+SP组大鼠脑组织JNKmRNA表达降低(P<0.05);Ani组LC3A、LC3B、Atg5、c-Jun、JNK mRNA表达增加(P<0.05),Bcl-2表达明显降低(P<0.05)。与SP组比较,Ani组Atg5、c-Jun、JNK mRNA表达明显升高(P<0.05),Beclin1、p62、Bcl-2 mRNA表达明显降低(P<0.05)。结论:化浊解毒活血通络方可上调LC3A/B、Beclin1、Atg5、JNK、p-JNK、c-Jun蛋白的表达,下调p62、Bcl-2蛋白表达;提高LC3A/B、Beclin1、Atg5、JNK、p-JNK、c-Jun mRNA表达,降低p62、Bcl-2 mRNA表达,表明化浊解毒活血通络方可通过JNK信号通路抑制自噬减少大鼠缺血/再灌注损伤。

化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠细胞自噬相关蛋白的抑制作用

目的:研究化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠细胞自噬相关蛋白的抑制作用。方法:50只SPF级SD大鼠随机分为5组:假手术组、模型组、中药组、抑制剂组、中药+抑制剂组。采用线栓法制备大脑中动脉缺血/再灌注模型,假手术组仅分离血管不进栓,各组予相应干预。给药3 d后观察各组大鼠神经功能评分,TTC检测脑组织梗死面积,HE染色观察脑组织结构变化,透射电镜观察自噬小体超微结构,Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)、Beclin1、p62、Atg5的表达情况。结果:与假手术组比较,模型组神经功能缺损评分显著升高(P<0.05),脑梗死面积显著增大(P<0.05),病理改变严重,电镜下自噬小体、自噬溶酶体清晰可见,LC3、Beclin1、Atg5表达显著升高(P<0.05),P62表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较,中药组、抑制剂组和中药+抑制剂组神经功能缺损评分均显著降低(P<0.05),脑梗死面积显著缩小(P<0.05),脑组织病理状态有所改善,电镜下细胞核核膜轻度融合,自噬小体、自噬溶酶体可见但数量较少,LC3、Beclin1、Atg5表达显著降低(P<0.05),P62表达显著升高(P<0.05)。结论:化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤有改善作用,可能与抑制细胞自噬,上调LC3、Beclin1、Atg5蛋白的表达,下调P62蛋白水平有关。

基于16S rRNA测序的肠道菌群探讨化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠脑-肠轴的影响

目的:研究化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠肠道菌群的影响,探讨中药调控肠道微生物群进而恢复脑-肠轴平衡的机制。方法:将50只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,化浊解毒活血通络方高(25.0 g·kg^(-1)),中(12.5 g·kg^(-1)),低(6.25 g·kg^(-1))剂量组,每组10只。参照Longa法并结合既往研究经验制备大脑中动脉梗塞大鼠模型,缺血2 h后再灌注。于脑缺血再灌注损伤72 h检测大鼠神经功能缺损情况、脑梗死范围百分比;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠结肠闭锁小带蛋白-1(ZO-1),闭锁蛋白(Occludin)mRNA表达;苏木素-伊红(HE)染色观察各组大鼠肠道组织、脑组织损坏程度;每组收集6只大鼠粪便进行16S rRNA测序;免疫组化、酶联免疫吸附测定试验(ELISA)检测肠道组织、外周血、脑组织调节性T细胞(Treg),辅助性T细胞17(Th17)的表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损症状加重(P<0.05),脑梗死面积增加(P<0.05);与模型组比较,化浊解毒活血通络方高、中剂量组大鼠神经功能缺损症状明显减轻(P<0.05),脑梗死面积减少(P<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠结肠黏膜结构破坏,上皮细胞、杯状细胞结构不完整;与模型比较,化浊解毒活血通络方高、中剂量组大鼠结肠黏膜破坏较少,上皮细胞、杯状细胞结构完整。与假手术组比较,模型组大鼠Occludin,ZO-1 mRNA表达降低(P<0.05),与模型组比较,化浊解毒活血通络方高剂量组Occludin,ZO-1 mRNA水平均有所增加(P<0.05)。模型组与假手术组肠道菌群微生态结构存在差异,化浊解毒活血通络方高剂量组与假手术组组群落结果更相近。与假手术组比较,模型组大鼠肠道组织、外周血、脑组织Treg细胞表达下降,Th17细胞表达升高(P<0.05);与模型比较,化浊解毒活血通络方高、中剂量组大鼠肠道组织、外周血、脑组织Treg细胞表达升高,Th17细胞表达下降(P<0.05)。结论:化浊解毒活血通络方可能通过调整肠道微生物的丰度和多样性,改善肠壁通透性,减少肠道Th17细胞迁移至缺血侧脑组织,减少炎症反应,进而减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。