乙酰丙酮法测定甲壳胺寡糖数均分子量

采用乙酰丙酮与氨基端反应的生色原理,将乙酰丙酮法应用于甲壳胺寡糖数均分子量的测定。通过对方法的重复性、精密性和稳定性试验,证明方法可靠。同时,通过对已报道测定甲壳胺寡糖端基相对分子质量的铁氰化钾法、HPLC法进行比较。结果表明:乙酰丙酮法比铁氰化钾法更适合甲壳胺寡糖数均分子量的测定。

羧甲基壳聚糖、盐酸氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖对大鼠胰岛细胞生长及胰岛素分泌量的影响

通过胶原酶消化法获得大鼠胰岛单层细胞 ,并用转板以及碘乙酸处理的方法除去其中的成纤维细胞 ,得到比较纯的胰岛内分泌细胞 ,以此为材料研究了羧甲基壳聚糖、盐酸氨基葡萄糖、N 乙酰氨基葡萄糖对大鼠胰岛细胞生长和胰岛素释放的影响。实验结果表明 ,羧甲基壳聚糖、盐酸氨基葡萄糖、N 乙酰氨基葡萄糖均能够促进大鼠胰岛细胞的生长。采用放射免疫法测定培养的胰岛细胞分泌胰岛素含量 ,结果表明 ,羧甲基壳聚糖具有刺激大鼠胰岛细胞胰岛素释放的作用。

壳聚糖酶的分离纯化及性质研究

以本实验室分离的产壳聚糖酶YJ02菌株出发,制备壳聚糖酶发酵液,经离心、(NH4)2SO4分级盐析、Q-SepharoseFast Flow阴离子交换、Sephacry S-100凝胶过滤分离纯化步骤,SDS-PAGE显示为一条带,壳聚糖酶纯化了28.9倍,收率为47.6%。该酶的性质研究表明,该酶的分子量为66.2KD,最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0;Mn2+对酶活力有明显的促进作用,Cu2+,Fe3+,Hg2+对酶活力有抑制作用;小分子有机物EDTA和SDS对酶活力有抑制作用,而IAA和β-巯基乙醇对酶活力稍有促进作用。该壳聚糖酶对高脱乙酰度壳聚糖底物水解作用强,酶解位点可能为NGlc-NGlc,酶最大反应速度Vmax=4.1μmol/min,常数Km为64mmol/L。此壳聚糖酶水解壳聚糖制备的壳寡糖数均分子量为2 400Da。

羧甲基壳聚糖中氨基葡萄糖含量测定方法的研究

以乙酰丙酮试剂结合分光光度法和以盐酸氨基葡萄糖为对照品 ,确定羧甲基壳聚糖的氨基葡萄糖含量测定方法。羧甲基壳聚糖在 6mol/LHCl、12 0℃条件下水解 2 .5h ,羧甲基壳聚糖水解样品溶液 ,效果较好 ;盐酸氨基葡萄糖对照品溶液和羧甲基壳聚糖水解样品溶液中的氨基葡萄糖与乙酰丙酮试剂进行定量反应 ,使溶液呈色 ,采用分光光度法进行定量分析 ,两者最大光吸收波长均为 5 2 5nm ,线性关系良好 ;该方法对氨基葡萄糖有较好的专属性、精密度和稳定性。可用于羧甲基壳聚糖的氨基葡萄糖定量分析。

褐藻酸降解菌的发酵培养及褐藻酸酶对褐藻细胞的解离作用

褐藻酸降解菌埃氏交替单胞菌 (Alteromonas espejiana)菌株 Al0 2发酵培养时褐藻酸酶形成条件研究表明 ,其产酶的培养基最适褐藻酸钠含量为0 .3～ 0 .6 % ,氮源为 0 .5 %的蛋白胨 ,p H7.5 ,装量是在 5 0 0 ml三角瓶中装培养基2 0 0 ml。培养温度为 2 5℃ ,培养时间为 1 44 h。利用该菌株进行发酵培养 ,制备褐藻酸酶。制备出的褐藻酸酶作用于海带和裙带菜 ,可使海带和裙带菜细胞游离产生大量的单细胞和原生质体。

几丁质酶研究现状及展望

几丁质酶 (EC3.2 .1.14)催化几丁质水解为几丁寡糖和 N-乙酰氨基葡萄糖 ,随研究深入 ,显示出越来越突出的生物学功能。本文介绍了几丁质酶的底物专一性、生理功能。

海藻工具酶研究Ⅱ.褐藻酸酶的制备、性质及对裙带菜细胞的解离研究

褐藻酸降解菌埃氏交替单胞菌（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｅｓｐｅｊｉａｎａ）菌株Ａｌ０１，通过发酵培养制备褐藻酸酶。该酶作用的最适ｐＨ为７．０，最适温度为４０℃，最适底物浓度为１％～２％；在离子浓度为０．５ｍｍｏｌ／ｄｍ３时，Ｍｎ２＋对酶促反应稍有促进作用，Ｃａ２＋、Ｈｇ２＋则有明显的抑制作用。该酶用于裙带菜单细胞和原生质体解离时，以酶液组成为褐藻酸酶１％、纤维素酶１％，４５ｘ１０－３的ＮａＣ１为渗透剂，酶解温度２５℃，ｐＨ７．０，酶解３－４ｈ效果最好。

水溶性低分子量壳聚糖对糖尿病大鼠血糖的影响

研究不同化学修饰的水溶性低分子量壳聚糖对糖尿病大鼠血糖的调节作用,以探讨其结构与功能的关系。本研究对低分子量壳聚糖、低分子量羧甲基壳聚糖和低分子量羧甲基甲壳素进行化学表征和分子量测定。通过腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠糖尿病模型,并随机分为糖尿病治疗组和模型组。治疗组大鼠每日按180 mg/kg体质量分别灌胃低分子量壳聚糖、低分子量羧甲基壳聚糖、低分子量羧甲基甲壳素,模型组按体质量灌胃相同体积的蒸馏水,连续灌胃45 d,于末次灌胃后测定大鼠空腹血糖、糖耐量、肝肌糖原含量,大鼠胰腺做病理组织切片观察。结果表明,不同化学修饰的水溶性低分子量壳聚糖的分子量在10 000~25 000 Da间,低分子量壳聚糖乙酰基取代度为52.71%,低分子量羧甲基壳聚糖的乙酰基取代度为7.50%、羧基取代度为98.16%,低分子量羧甲基甲壳素的乙酰基取代度为89.96%、羧基取代度为98.65%;三者均可显著降低糖尿病大鼠空腹血糖水平,改善糖耐量,提高肝肌糖原含量。其中,低分子量羧甲基甲壳素组效果最好,低分子量壳聚糖效果次之,推测水溶性低分子量壳聚糖的乙酰基可能在糖尿病大鼠血糖调节中发挥重要作用。

产甲壳素酶菌株的发酵条件、酶的分离纯化及酶学性质研究

利用甲壳素为唯一碳源从土壤中筛选得到1株产甲壳素酶活力较高的菌株HD002,初步鉴定其为Massilia属。确定菌株产甲壳素酶的最适培养基组成为(g/L):(NH4)2SO45,K2HPO40.7,KH2PO40.3,MgSO4.7H2O 1,胶体甲壳素10;最适产酶培养条件为:培养基起始pH值6.0,培养时间192 h,发酵液酶活力达1.314 U/mL。采用70%饱和度硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose F.F阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析对该甲壳素酶进行纯化,SDS-PAGE证明达到电泳纯。该甲壳素酶的分子量为60.2 kDa,最适反应温度为55℃,最适反应pH值为5.0,Cu2+和Fe3+对酶活力有明显的抑制作用,Ca2+和Na+对酶活力有明显的促进作用。

单环刺螠纤溶酶Ⅲ基因克隆及原核表达

单环刺螠(Urechis unicinctus)纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化得到的一组有抗凝和纤溶活性及较好生物安全性的纤溶酶。本研究为获得重组表达的UFE,根据该纤溶酶Ⅲ的(UFEⅢ)N端测序结果,设计简并引物,扩增出该蛋白的部分基因编码序列,利用5′-RACE PCR获得(UFEⅢ)的cDNA全长序列863bp,其中开放阅读框编码261个氨基酸。通过生物信息学分析其为丝氨酸蛋白酶家族成员,并与之前实验室提取的UFEⅢ进行同源性分析,推测其为一组同工酶。以PMD18-T-UFE为模板,扩增单环刺螠纤溶酶的成熟肽片段,构建重组表达载体pET32a-UFE和pET28a-UFE,转入Rosetta2(DE3)菌中诱导表达,UFEⅢ分别以可溶蛋白和包涵体的形式得到了表达。

海藻工具酶研究I.褐藻酸降解菌的分离鉴定及其褐藻酸酶形成条件研究

海带、裙带菜病烂处分离得到５株褐藻酸降解菌，经鉴定属于埃氏交替单胞菌（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｅｓｐｅｊｉａｎａ）（菌株Ａ１０１、Ａ１０２，Ａ１０３、Ａ１０５）、麦氏交替单胞菌（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｍａｃｌｅｏｄｉｉ）（菌株Ａ１０４）．菌株Ａ１０２发酵培养时，褐藻酸形成条件的研究表明，培养基含０．３％～０．６％的褐藻酸钠，０．５％的蛋白胨，ｐＨ７．５，装量为５００ｃｍ３三角瓶装２００ｃｍ３培养基，在２５℃下培养１４４ｈ较为适宜。

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化出的1组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活性和纤溶活性以及较好的生物安全性。根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3-’RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5-’RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp。该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsindomain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。

转基因聚球藻(Synechococcus sp) 生长条件研究

以转基因聚球藻为材料，研究了 其在f/2培养液中培养时，培养温度、光照强度、培养液起始pH和盐度对生长的影响。结果 表明，该聚球藻培养的最适条件为：温度35℃，光照强度5000lx，培养液起始pH8.5，盐度1 5～30。

植物激素对海带配子体克隆附着的影响

实验研究 2 ,4 - D、KT、IAA、NAA四种植物激素对海带配子体克隆附着的影响。结果表明 :2 ,4 - D对附着有较明显的促附着作用 ,最有效浓度为 2 .5mg/L 和 5mg/L,其 4 h的附着率分别是对照的 2 .79倍和 2 .95倍 ;KT的作用较复杂 ,在浓度为 1mg/L 时 ,对附着有明显的促进作用 ,其 4 h的附着率是对照的 2 .3倍 ;IAA对配子体附着没有明显的促进或抑制作用 ;NAA对附着有抑制作用 ,浓度越高 ,抑制作用越强。

壳寡糖及其衍生物对实验性糖尿病大鼠调节血脂和抗氧化作用

研究了不同剂量的壳寡糖,N-乙酰氨基单糖对STZ诱导的糖尿病大鼠的调节血脂和抗氧化作用.按65 mg/kg一次性腹腔内注射(ip)STZ制备糖尿病大鼠模型,随机分成糖尿病治疗组和糖尿病对照组.治疗组分别用壳寡糖、N-乙酰氨基单糖水溶液按每日250 mg/kg,500 mg/kg,1 500 mg/kg灌胃,正常对照组,阴性对照组按体重灌胃等体积蒸馏水(10 mL/kg),阳性对照组按每日200 mg/kg灌胃二甲双胍水溶液,连续60 d.对DM大鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛浓度以及总抗氧化能力及甘油三酯、总胆固醇、载脂蛋白A1、载脂蛋白B、载脂A1/载脂B等指标进行测定.研究结果表明不同剂量的壳寡糖和N-乙酰氨基单糖均能不同程度地改善糖尿病大鼠的体重减轻、多饮、多食等症状.壳寡糖各剂量组对总抗氧化能力、SOD活力均有显著改善,MDA浓度与阴性对照组比较均有极其显著差异(P<0.001),且剂量越高总抗氧化能力越强,MDA浓度越小,但SOD活力降低.壳寡糖组甘油三酯与正常组浓度无显著差异,胆固醇浓度轻度升高,载脂蛋白B质量浓度相对阴性对照组降低,中剂量组有显著差异(P<0.050),各剂量组载脂A1/载脂B值与阴性对照组比较有显著差异,中剂量组效果最好;N-乙酰氨基单糖各剂量组对总抗氧化能力的改善效果与阴性对照组比较均无显著差异(P>0.050),中、低剂量组SOD活力显著升高,MDA浓度与阴性对照组比较均有极其显著差异(P<0.001),且剂量越低总抗氧化能力越强,MDA浓度越小,SOD活力增加.N-乙酰氨基单糖各剂量组甘油三酯,载脂蛋白B质量浓度相对阴性对照组较低,载脂A1/载脂B值降低与阴性对照组比较均有极显著差异(P<0.01),低剂量组效果最好.不同剂量的壳寡糖和N-乙酰氨基单糖均能不同程度地调节糖尿病大鼠血脂和提高其机体抗氧化能力,壳寡糖中、高剂量组与N-乙酰氨基单糖低剂量组效果较好.

壳聚糖酶高产菌株的筛选和发酵条件的研究

从采集的土样中分离到1株产壳聚糖酶能力较强的菌株OU01,并对OU01进行了16S rDNA序列、形态及生理生化鉴定分析。16S rDNA序列分析表明该菌属于微杆菌属;该菌的形态特征与生理生化鉴定结果表明该菌与Microbacteriumsp.的相似性最高;因此将其初步鉴定为微杆菌属(Microbacterium)。同时对该菌的发酵条件进行了初步研究:该菌的最适培养基组成为(g/L):chitosan 10,(NH4)2SO420,MgSO4.7H2O 1.3,K2HPO4.3H2O 1.4,Glucose 1,Yeast extract 3,NaCl 5,起始pH=6.30。最适发酵温度为30℃,最佳发酵时间为96 h,在上述最优条件下,该菌株产酶达到118 U/mL。Microbacteri-umsp.OU01菌株为壳聚糖酶的研究和应用提供了新的来源。

不同分子量壳聚糖膜性质的研究

分别以分子量为 130 ,0 0 0、2 2 0 ,0 0 0、30 0 ,0 0 0、5 5 0 ,0 0 0道尔顿的壳聚糖制备壳聚糖膜 ,并研究了各膜的表面结构、结晶性、力学特性、渗透性、透光透气性、吸附性、生物降解性等。结果表明壳聚糖膜的各种特性和壳聚糖的分子量相关 ,高分子量的壳聚糖膜表面较为光滑 ,透光性较好 ,透气性、渗透性和生物降解性较差 ;低分子量的壳聚糖膜表面较为粗糙 ,透气性、渗透性和生物降解性较好 ,但透光性较差。经分析认为膜的结晶性和超微结构决定了不同分子量壳聚糖膜具有不同的性质。

壳聚糖在组织工程中应用的研究进展

壳聚糖是由 2 -氨基 - 2 -脱氧 - β -D -葡萄糖通过β - 1 ,4糖苷键聚合的一种天然聚阳离子生物多糖 ,结构类似硫酸软骨素、透明质酸等物质 ,体内移植或注射无炎症和变态反应 ,在动物体内可被降解为氨基葡萄糖 ,参与代谢 ,表现出良好的生物相容性和生物可降解性 ,是细胞培养的良好的脚手架 ,因而在组织工程中显示出较为广泛的应用前景。综述了壳聚糖在皮肤修复、神经修复、骨及软骨修复。

壳寡糖及其衍生物对CCl_4诱导的小鼠肝损伤的保护作用

研究壳寡糖(COS)、氨基葡萄糖(GlcNH2)和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)对CCl4诱导的雄性昆明种小鼠肝毒性的保护作用,并探讨其可能机制.小鼠腹腔注射CCl4(20 mg/kg体重)24 h后,血清天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性明显提高,引起肝脏脂质过氧化反应,巯基含量降低,总抗氧化能力(T-AOC)减弱,诱发基因毒性.提前连续12天分别灌胃给予COS,GlcNH2和GlcNAc(1.5 g/kg体重)能够显著诱导金属硫蛋白(MT)的表达,体内的抗氧化防御系统随之增强以抵抗CCl4诱导的氧化损伤.血清AST和ALT活性明显降低,肝脏丙二醛(MDA)生成被抑制,巯基含量,T-AOC明显恢复.但是,从DNA电泳结果反应出的基因毒性并未减轻.实验结果证明,提前给予COS,GlcNH2和GlcNAc对CCl4诱导的小鼠肝损伤能够起到有效的保护作用,其中,GlcNH2的作用效果最显著.