全基因组选择信号鉴定高原型藏羊毛用性状候选基因及关联分析

旨在通过全基因组受选择区域信号检测结合单核苷酸多态性与性状关联分析鉴定出高原型藏羊羊毛性状新的分子标记和候选基因。本研究采集3~4周岁健康母羊耳组织与羊毛作为试验素材,其中高原型藏羊母羊119只,欧拉型藏羊母羊89只,总计208只。利用群体遗传分化指数(Fst)和碱基多样性比值(Pi Ratio)进行全基因组选择性清除分析,通过功能注释筛选候选基因,并进行GO和KEGG富集分析,对108只高原型藏羊进行候选基因外显子Sanger测序单核苷酸多态性与表型数据关联分析,鉴定出与羊毛性状相关的功能位点。分析结果表明:共有1084个受选择区域,注释到1037个候选基因;通过对功能基因的注释并结合文献分析,发现GHR、FGFR3、MC 1R、MITF、FGF5、WNT 2B和WNT 5A等7个基因与羊毛性状有潜在关联,其中FGF 5(exon6:c.954C/T:p.227P/P)同义突变位点和首次发现的FGFR 3(exon6:c.1092C/T:p.364A/A)同义突变位点与羊毛纤维性能关联,并且2个位点均未偏离哈温平衡,这2个基因可能是高原型藏羊羊毛性状重要的候选基因。本研究发现有助于了解高原型藏羊羊毛性状的生产遗传基础,为该品种绵羊的分子育种技术提供参考,也为保护与利用地方优异种质遗传资源提供科学依据。

青海湖裸鲤实时荧光定量PCR内参基因筛选与验证

为探明青海湖裸鲤候选内参基因在低温环境下的表达稳定性,根据RNA-seq定量结果筛选表达稳定的候选内参基因,利用实时荧光定量PCR检测候选基因在0℃和17℃下,脑、肝胰脏、肌肉组织中的表达量,并通过GeNorm、Norm Finder和Best Keeper3种分析程序分析其表达稳定性,筛选出理想的内参基因。结果显示:根据RNA-seq定量结果,共筛选获得脱水酶(Abhd18)基因、微球蛋白(B2m)基因、延伸蛋白A(Eloa)基因、DAZ相关蛋白2(Dazap2)基因、肌动蛋白(Actb)基因、磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh)基因、BCL细胞死亡激动因子(Bad)基因和脂肪酸结合蛋白3(Fabp3)基因等8个候选基因;对上述基因的表达稳定性进行分析,发现表达最稳定的是B2m和Eloa基因,表达最不稳定的是Fabp3基因;利用B2m和Eloa基因作为双内参基因对4个脂肪酸代谢相关基因在0℃和17℃脑、肝胰脏、肌肉组织中的表达量进行校正,其相对表达比值与RNA-seq结果高度正相关。研究结果可为高原鱼类极端环境适应的研究提供候选内参基因。

饲料蛋白质水平对三倍体虹鳟生长和肠道组织形态的影响

在水温8~16℃下,将初始体质量为(233.30±0.39)g的三倍体虹鳟Oncorhynchus mykiss饲养在规格为3m×3 m×6 m的网箱中,网箱放在青海省龙羊峡水库,每箱100尾,分别投喂蛋白质水平为35.4%(低蛋白质组)、43.3%(中蛋白质组)和52.4%(高蛋白质组)的等脂等能饲料,每种饲料4个网箱,探讨饲料蛋白质水平对三倍体虹鳟生长和肠道组织形态的影响。80 d的饲养结果表明:随着饲料蛋白质水平的增加,特定生长率、肠道皱襞高度和上皮细胞厚度呈显著上升的趋势(P<0.05);与低蛋白组相比,中蛋白组和高蛋白组特定生长率分别高出14.4%和22.1%;肠长指数(肠长/体长×100%)、Zihler指数(肠长(mm)/[10×(体质量(g)1/3)])、肠道微绒毛高度和肌层厚度呈显著下降的趋势(P<0.05);饲料蛋白质水平对三倍体虹鳟肠道中杯状细胞数量无显著影响(P>0.05)。综上所述:投喂高蛋白质水平饲料能促进三倍体虹鳟生长,其原因是投喂高水平蛋白质饲料(52.4%)增大了鱼肠道表面积,提高对饲料的消化吸收率;投喂低水平蛋白质饲料(35.4%)可能导致肠道炎症。

高原三倍体虹鳟石蜡切片制作方法的改良与验证

目的摸索、明确高原三倍体虹鳟石蜡切片制作参数,并进行高原三倍体虹鳟石蜡切片制作方法的改良与验证。方法以高原三倍体虹鳟新鲜的鳃、肠和肝脏组织为材料,采用石蜡切片和苏木精-伊红染色技术,观察不同脱水及透明程序对切片质量的影响,探索最佳脱水及透明时间。结果高原三倍体虹鳟鳃、肠和肝脏组织脱水及透明时间存在差异,其中肠道组织脱水时间最短,肝脏组织透明时间最长。各组织切片在本研究中最佳脱水及透明程序下呈现出组织细胞完整、核质清晰和染色鲜艳。结论初步探索出高原三倍体虹鳟组织石蜡切片的最佳制作条件。

Cu^(2+)胁迫下花斑裸鲤IL-8基因的组织表达分析

采用RT-PCR及cDNA末端快速扩增技术克隆了花斑裸鲤IL-8基因的全长及生物信息学特征,用Real-time PCR技术分析GeIL-8mRNA在花斑裸鲤各个组织中的表达分布,研究黄河上游水域水质污染的生物标记物,为水环境污染的早期预警以及花斑裸鲤的保护提供参考。结果表明:花斑裸鲤GeIL-8序列共582bp,由45bp的5'-UTR、240bp的3'-UTR和297bp的编码区构成,编码98个氨基酸;GeIL-8基因核苷酸序列与鲫鱼的同源性最高(87%)。Real-time PCR结果表明,正常条件下花斑裸鲤GeIL-8肝组织中的表达量最高,其次是鳃,在肾和脑组织中表达量较低;在Cu^(2+)胁迫下,花斑裸鲤肝脏、肾脏、脑和鳃组织的GeIL-8在mRNA水平的表达量总体均表现为先升后降的规律性应答,说明Cu^(2+)能够诱导GeIL-8的表达,也表明GeIL-8是潜在的反映水环境质量的生物标志物。研究结果提示,IL-8可作为黄河上游水域水质污染的生物标记物。

三倍体虹鳟实时荧光定量PCR内参基因稳定性分析

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、核糖体大亚基蛋白基因(rplp2)、真核延伸因子基因(ef1-α)、β-肌动蛋白(β-actin)和18S核糖体核酸基因(18S rRNA)等5个候选内参基因在体质量约800 g三倍体虹鳟脑、眼、鳃、皮肤、心脏、肾脏(头肾、中肾、后肾)、肝脏、脾脏、胃、幽门垂、肠(前肠、中肠、后肠)以及肌肉(红肌、白肌、肌间隔)等组织中的表达水平,通过内参基因表达的Ct值比较,并采用GeNorm、Best-Keeper、NormFinder 3种软件分析5个候选内参基因的表达稳定性。GeNorm分析显示,5个候选内参基因的平均表达稳定值(M)依次为β-actin=rplp2<ef1-α<18S rRNA<gapdh,其中β-actin和rplp2 M值最小,为1.42。Best-Keeper分析显示,5个候选内参基因的标准偏差依次为rplp2<ef1-α<β-actin<18S rRNA<gapdh,变异系数依次为rplp2<ef1-α<β-actin<gapdh<18S rRNA,其中rplp2标准偏差(0.92)和变异系数(3.94%)均最小。NormFinder分析显示,5个候选内参基因的平均表达稳定值依次为rplp2=β-actin<ef1-α<18S rRNA<gapdh,其中rplp2与β-actin稳定值最小(0.66)。综上所述,5个候选内参基因中rplp2与β-actin内参基因表达最稳定,建议rplp2与β-actin作为三倍体虹鳟实时荧光定量PCR分析的适宜内参基因。

高原花斑裸鲤过氧化氢酶(CAT)基因的克隆鉴定表达及其对Cu^(2+)胁迫的应答

目的对高原花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)过氧化氢酶(catalase,CAT)基因做克隆鉴定表达,并对其做Cu^(2+)胁迫的应答分析,为进一步研究抗氧化酶类与氧化应激之间的关系,筛选其为有效生物标记物提供理论依据。方法采用RT-PCR和RACE技术获得高原花斑裸鲤CAT全长c DNA序列,分析生物信息学特征及在不同组织的表达分布特征。在Cu^(2+)的胁迫下,通过Real-time PCR检测高原花斑裸鲤肝、肾、脑、鳃组织中CAT在转录水平上的应答规律。并对上述结果行有效分析。结果 CAT基因(命名为Ge CAT,Gen Bank登录号为MG762770)的完整编码序列全长2263 bp,含5'-UTR 158 bp、3'-UTR 440 bp和完全开放阅读框(ORF)1665 bp,ORF编码555个氨基酸。在Cu^(2+)胁迫下,高原花斑裸鲤肝、肾、脑、鳃组织中的Ge CAT在转录水平相对表达量呈现出一定的规律性:均先升高后降低。结论获得了花斑裸鲤CAT基因的生物信息学特征和表达分布特点,初步分析了Ge CAT对Cu^(2+)胁迫的应答模式。

高原花斑裸鲤Cu/Zn-SOD的克隆鉴定表达及其对Cu^(2+)胁迫的应答

目的对高原花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)铜锌-过氧化物岐化酶(Cu/Zn-Superoxide Dismutase,Cu/Zn-SOD)基因的克隆鉴定表达及对其Cu^(2+)胁迫的应答分析。方法采用RT-PCR和RACE技术获得G.eckloni Cu/Zn-SOD全长c DNA序列,分析生物信息学特征和在不同组织的表达分布。在Cu^(2+)的胁迫下,通过实时定量PCR检测花斑裸鲤肝、肾、脑、鳃组织中Cu/Zn-SOD的表达变化,探究其是否能够作为响应重金属污染胁迫的一种生物标记物。结果Cu/Zn-SOD的cDNA序列全长785 bp,其中3'-UTR为277 bp,5'-UTR为43 bp,编码区为465 bp,可编码154个氨基酸(Gen Bank登录号为:KX826080)。在Cu^(2+)胁迫下,花斑裸鲤肝、肾、脑、鳃组织中的Ge Cu/Zn-SOD在mRNA水平相对表达量呈现出一定的规律性。结论成功实现高原花斑裸鲤Cu/Zn-SOD的克隆鉴定表达,初步得到了花斑裸鲤Cu/Zn-SOD对Cu^(2+)胁迫的应答模式。

青海湖裸鲤特征挥发性成分分析

为分析青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)特征挥发性成分,以体重为20g的青海湖裸鲤作为研究对象,剖取肌肉后采用固相微萃取(SPME)结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)对裸鲤肌肉挥发性成分进行分离鉴定。结果表明,在青海湖裸鲤肌肉中检测出60种化合物,包括8种醇类化合物、9种醛类化合物、5种酮类化合物、2种酸类化合物、8种酯类化合物、12种烃类化合物、12种芳香族化合物及4种其他类物质,其中芳香族化合物含量最高。结合气味活度值(OVA)分析,青海湖裸鲤肌肉挥发性气味的主要贡献化合物为1-辛烯-3-醇、己醛、辛醛、壬醛、2-癸烯醛及2,4-癸二烯醛。

青海湖裸鲤CYP17a2基因的克隆及表达分析

CYP17a2基因是细胞色素CYP17（cytochrome P450,CYP）超家族成员之一,在卵巢发育过程中,可以与CYP17a1共同作用控制卵子的发育和成熟。研究和掌握青海湖裸鲤（Gymnocypris przewalskii）卵巢发育的基本规律,可为该鱼种的人工增殖放流及其资源保护和恢复提供技术支撑。本研究采用普通PCR和RACE方法克隆得到了青海湖裸鲤CYP17a2基因全长c DNA序列,并分析了其生物信息学意义,通过实时荧光定量PCR确定了CYP17a2基因在青海湖雌性裸鲤各组织中的表达分布特征。该基因的c DNA序列全长为1 871 bp,共编码390个氨基酸,所编码的氨基酸序列与斑马鱼和鲤鱼的同源性最高,分别为69%和64%。该基因在卵巢、卵巢膜、脑、肌肉、肝胰脏中均有表达,以在卵巢中表达量最高（p〈0.01）。本研究结果将为进一步开展CYP17a2基因在青海湖裸鲤卵巢发育的分子调节机理的研究中提供基础数据。