糖基转移酶UGT73C5在大肠杆菌中的可溶性表达研究

络塞是一种抗高原反应药物的主要活性成分,可通过尿苷二磷酸糖基转移酶UGT73C5催化肉桂醇糖基化反应合成。然而UGT73C5在大肠杆菌宿主中可溶性表达极差,严重限制了其工业应用。该研究分别通过与分子伴侣共表达和与助溶蛋白标签融合表达的方式,提高UGT73C5在Escherichia coli BL21(DE3)中的可溶性表达。结果显示,除质粒pKJE7外,与分子伴侣质粒pG-KJE8、pGro7和pG-TF2共表达后均可提高UGT73C5酶活力,分别为原始酶活力(18.56 U/g细胞)的1.27、1.18、1.37倍。此外,利用硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)和谷胱甘肽巯基转移蛋白(glutathione S-transferase,GST)两种助溶蛋白标签,构建的融合酶Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5的酶活力为原始酶活力的1.45、2.54倍,且纯化后的比酶活力为原始酶的80%~90%。最后,在2 mmol/L肉桂醇合成络塞的反应中,相同浓度细胞破碎液(粗酶)融合酶GST-UGT73C5比原始酶催化效率更高,4 h后转化率可以达到90%以上,最终转化率达到93.6%。因此,助溶蛋白标签融合表达法可有效提高UGT73C5在大肠杆菌中的可溶性表达,且融合酶GST-UGT73C5在络塞的酶法合成中具有更大的应用潜力。

角蛋白酶在牛皮脱毛工序中的应用研究

Bacillus cereus SZ-4粗酶液在牛皮的脱毛试验结果表明:它能有效降解毛囊与毛干联接部位的组分,除去纤维间质和松散胶原纤维。因为能够取代硫化碱,Bacillus cereus SZ-4将成为开发无硫生物脱毛助剂生产技术有潜力的菌株。未经软化工序处理的样品加工成革后,其感官性能和物理性能与毁毛法处理的样品无显著差异,进一步优化了脱毛和浸灰工艺,有望省略软化工序。并且,样品处理废液中BOD5、COD、TOC等主要污染指数明显降低,实现了环保的目的。

乳酸菌和酵母共培养技术缩短郫县豆瓣酱陈酿期的应用研究

耐盐乳酸菌和酵母菌接种到郫县豆瓣的酱醅中共培养,陈酿8个月后,试验组的总酯显著增加,接近自然陈酿12个月的水平,氨基酸态氮、总酸等理化指标无显著差异。通过HS-SPME耦联GC-MS技术检测4个月和8个月陈酿酱醅挥发性组分的分析结果表明,十四烷酸、十六碳酸、棕榈酸、亚油酸和15-甲基-十七(碳)酸的乙酯衍生物等酯香主体成分成倍增加。Glu、Asp、Ser、Thr、Ala等对呈味有显著影响的组分也有较大增幅。研究结果表明,乳酸菌和酵母菌的协同作用具有促进酯化,呈味氨基酸形成及抑制杂菌的作用,对其风味改善贡献显著。

郫县豆瓣挥发性香气成分剖析及其在陈酿过程中的变化研究

采用HS-SPME方法提取郫县豆瓣酱的挥发性组分,经GC-MS分离鉴定出8类共计82种化合物,其中酯类物质所占比例最高,其次是酚类和醇类组分。郫县豆瓣的特殊香味是多种芳香物质相乘作用赋予的,其中棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、油酸乙酯、4-乙基苯酚、4-乙基愈创木酚及苯乙醇贡献最大。比较不同陈酿年份的酱醅中各类挥发性组分的变化表明,5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、3-蒈烯和β-榄香烯等多种成分是在陈酿过程中形成的。此外,随着陈酿时间的延长,酯类组分含量先增后减,且不饱和脂肪酸酯降低幅度显著,酚类与醇类组分呈相反的波动趋势,而其他组分均呈逐渐增加的趋势。

角蛋白酶脱毛机理探究(一):脱毛条件的优化

生物脱毛是制革清洁化生产中的研究热点,角蛋白酶由于其特异性可将对胶原的水解降低,提高成革质量,但尚未完全阐明其脱毛机理。应用已筛选得到的产角蛋白酶菌株发酵液于制革脱毛,探究其在制革工序中的脱毛机理。采用单因素实验优化脱毛实验条件,在最佳条件下进行脱毛,结合组织学方法观察不同脱毛程度及脱毛条件下的皮质状况。基于皮质状况评定,该角蛋白酶粗酶液脱毛最佳条件为:脱毛酶活力单位160 U/mL,pH9和30℃;组织学观察结果表明,该产角蛋白酶菌株的发酵粗酶液中含有一类酶其作用机理如传统脱毛蛋白酶,通过作用基底膜,破坏粘性蛋,使毛根与毛囊脱离,此外,该粗酶液中含有角蛋白酶特异性分解角蛋白,提高脱毛效率。该产角蛋白酶菌株所产粗酶液的脱毛过程是各种酶协同作用,脱毛效果较优,较为适合生物脱毛,具有潜在的应用价值。

角蛋白酶生产菌种选育及脱毛应用的研究

以可溶性角蛋白为诱导底物,采用综合CS/CZ比值、活力大小与脱毛效果的集成定向诱导选育技术,从制革污水样品中,筛选到脱毛效率高的角蛋白酶野生菌株。应用菌落形态特征、部分生理生化、Biolog菌种鉴定系统和基于16S rDNA的分子生物学方法等多相分类鉴定技术鉴定,确定该分离株为Bacillus cereus,并命名为Bacillus cereus B-8。其粗酶液应用于绵羊皮脱毛实验的结果表明,该酶液可取代硫化碱,高效地使绵羊皮脱毛。应用组织形态学方法对脱毛机理的探讨表明,酶是沿毛干渗透到毛根部,破坏毛囊与毛袋、毛球与毛乳头之间的联结组织,削弱其联结,随后借助机械作用,使毛脱离表皮,实现无硫脱毛的目的。研究结果表明该分离株是开发无硫生物助剂生产技术的候选微生物菌株。

红曲霉培养条件对酯化力影响的研究

以A13、As3.554和As3.972为研究对象,比较了其培养参数米坯的初始水分、培养时间及以葡萄糖和蔗糖为速效碳源及添加量对底物己酸和乙醇转化为脂肪酸酯的酯化力的影响规律。实验结果表明,蒸米坯的初始水分、培养时间对其酯化力均有显著的影响,其最适水分为50%,培养时间为24d,葡萄糖可作为其培养初期的速效碳源,添加量视其菌株性能而存在一定差异。HS-SPME耦联GC-MS剖析不同红曲菌株制成的曲粉所催化得到的产物组分表明,其主要产物与总酯化力之间存在相关性,其酯化物的种类取决于菌株的特性。

优化黑曲霉柠檬酸生产菌株原生质体形成条件及表达系统的建立

优化了黑曲霉柠檬酸生产菌株的原生质体形成条件并建立基因表达系统。利用酶解法制备原生质体,最优的酶解液配比为5 mg/m L溶壁酶、0.2 U/m L几丁质酶和460 U/m L葡萄糖醛酸酶。最优的渗透压稳定剂为0.7 mol/L KCl,菌丝层厚度50μm,菌体量为0.003 g/m L。在培养基中添加1 mmol/L Mn2+有助于减少原生质体形成所需的酶量,在培养基中添加葡萄糖醛酸酶有助于得到独立的孢子进行萌发,从而促进原生质体的形成。利用共转化的方式,可以同时将两个表达框整合到基因组上并实现基因表达。

秸秆碱预处理液脱毒及其在丁醇发酵中的应用

秸秆的碱预处理液可造成严重的环境污染。该研究基于源头控制的理念,对碱预处理液进行脱毒工艺研究并回收进行丁醇发酵研究。通过加酸去除碱预处理液中的木质素,用活性炭将去除木质素的预处理液脱毒并用于水解和发酵过程。优化获得沉淀碱溶性木质素的最佳pH 3.8;不同加量活性炭脱毒后的碱预处理液对秸秆水解的影响不明显,然而活性炭的添加量对丁醇发酵影响较大,当活性炭添加量为15 g/L时,发酵72 h达到最高丁醇质量浓度10.2 g/L。该秸秆碱预处理液脱毒工艺对利用秸秆进行无废生产生物燃料有一定参考价值。

可得然胶生产菌种的筛选及发酵条件优化

采用苯胺蓝平板筛选法从土壤中筛选并鉴定了一株产可得然胶的根瘤菌,并对该菌株发酵合成可得然胶的培养基进行优化。在单因素优化的基础上,设计4因素3水平的正交优化方案,优化结果显示,该菌株发酵产可得然胶的最优培养基组成为:葡萄糖50 g/L,(NH4)2HPO42g/L,KH2PO41.5 g/L,Mg SO41.25 g/L,Fe SO4·7H2O 0.05 g/L,Mn SO40.02 g/L,Co Cl2·6H2O 0.01 g/L,Zn Cl20.01 g/L。经摇瓶发酵验证,可得然胶的产量和糖转化率较优化前分别提高了29.2%和5.4%,为进一步利用该根瘤菌发酵合成可得然胶奠定了良好基础。

Clostridium saccharobutylicum DSM 13864细胞表面理化特性及固定化细胞产丁醇的性能

糖丁基梭菌Clostridium saccharobutylicum DSM 13864能利用多种糖类为底物发酵产丁醇。本文研究了该菌体细胞表面的理化特性,并以砖块作为细胞固定化材料进行丁醇发酵。采用细菌吸附有机溶剂（MATS）法证明糖丁基梭菌细胞表面有强烈的亲水性,并且等电点在p H值为3左右,这些特性有利于菌体与表面亲水多孔的砖块吸附。在60g/L葡萄糖发酵培养基中,以5~8目砖块作为固定化材料,流速为1.1L/min,发酵48h后,丁醇的浓度、得率和生产率分别达到11.02g/L、0.18g/g和0.23g/（L？h）,相比悬浮细胞发酵分别提高了10.53%、5.88%和9.52%。结果表明：砖块作为一种固定化材料可有效提高糖丁基梭菌的发酵产丁醇水平。

恶臭假单胞菌的正丁醇耐受性驯化及比较基因组学分析

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是一类非常重要的工业微生物,广泛用于环境修复、生物活性物质合成等方面。作者采用常压室温等离子体诱变技术(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)对实验室保藏的恶臭假单胞菌901进行随机诱变,以正丁醇作为筛选压力进行驯化培养,最终筛选得到一株能耐受12 g/L正丁醇的突变株。通过Illumina HiSeq平台进行全基因组重测序和生物信息学分析。结果显示共获得大约1 900万对reads,平均读长为150 nt,与参考基因组的片段配对率为92.03%,覆盖率为90.34%。共检测到40 704个单核苷酸位点变异(singlenucleotide variation,SNV),其中纯合的为39 319个,杂合的为1 385个;存在2 153个基因小片段插入/缺失序列(insert&deletions,InDels),其中纯合的突变位点数量为1 871个,杂合的突变位点数量为282个。最后,将所有突变进行GO/KEGG数据库功能注释,发现突变数目最多的是代谢相关基因,其中以氨基酸代谢和糖代谢路径相关基因为主。

3-磷酸甘油醛脱氢酶促进谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸

在谷氨酸棒状杆菌( Corynebacterium glutamicum )SNK118中表达NADP +依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因,提高胞内NADPH水平,以提高 L -精氨酸( L -Arginine)和 L -鸟氨酸(L-Ornithine)发酵产量。通过NCBI数据库检索,选取了3个不同来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因。经测定酶活力,最终选择糖丁基梭菌( Clostridium saccharobutylicum) DSM13864来源的NADP +依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因( CsgapC )。构建了产 L -精氨酸的重组菌SNK118/pXMJ19- CsgapC,当摇瓶发酵70 h时产 L -精氨酸11.55 g/L,糖酸转化率0.13 g/g,与对照菌SNK118/pXMJ19相比,精氨酸产量和糖酸转化率分别提高了26%和10.2%。在 L -鸟氨酸生产菌株SNK118Δ argF Δ argR 中重组表达 CsgapC,重组菌SNK118Δ argF Δ argR /pXMJ19- CsgapC 摇瓶发酵70 h产 L -鸟氨酸27.76 g/L,糖酸转化率0.274 g/g,与对照菌SNK118Δ argF Δ argR /pXMJ19相比, L -鸟氨酸产量和糖酸转化率分别提高了20.1%和15.6%。结果表明,异源表达 CsgapC 有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵生产 L -精氨酸和 L -鸟氨酸的水平。

全局转录机制工程法筛选丁醇耐受大肠杆菌及性质

作者旨在采用一种快速有效的方法(全局转录机制工程方法)筛选一株具有较高丁醇耐受性的大肠杆菌。通过对全局转录因子σ^(70)进行随机突变,构建rpoD(编码σ^(70)因子)突变库。并采用高通量筛选的方法筛选获得丁醇耐受突变株E. coli JM109/pHACM^(B8),并对该突变株的性质进行了研究。结果表明:丁醇耐受突变株B8能够耐受体积分数2%丁醇,且对其他有机溶剂也具有较高的耐受性,如体积分数3%异丁醇、体积分数8%乙醇、体积分数4%环己烷和体积分数0.3%甲苯。为进一步阐明了B8菌株丁醇耐受机制,分别对B8菌株和对照菌株E. coli JM109/p HACM^(WT)的生理特性进行了研究。结果显示突变株B8胞内的丁醇含量较对照菌株低55%;且在酸性环境下比对照菌株生长更好;此外Mg^(2+)有助于提高菌株B8的丁醇耐受性。本研究为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。

产D-海因酶微生物的筛选及其催化特性

为获得高活性和立体选择性海因酶生产菌株,首先采用氨基酸关环法合成了数种5'-单取代海因衍生物及N-氨甲酰-氨基酸,建立了相关液相色谱检测方法。然后以实验室保藏的野生菌株出发,利用底物诱导的方法筛选到6株具有D-海因酶活性的野生菌,其中荧光假单胞菌产生的D-海因酶具有较好的底物谱,较高的活性和立体选择性。经优化后,其最适产酶温度为30℃,培养时间为12 h,发酵活力达到92.1 U/L。该菌催化D-海因水解的最适反应温度为60℃,pH 8.5。在50 m L体系中,利用0.25 g菌体(干重)可对映选择性水解20 mmol/L对羟基苯海因底物,反应3 h转化率达到98%。

亚位点＋1处突变提高软化类芽胞杆菌环糊精糖基转移酶底物麦芽糊精特异性

通过改造来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)的+1亚位点提高其对麦芽糊精的底物特异性,并进一步提高以麦芽糊精为糖基供体催化合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的效率。首先对+1亚位点附近的3个氨基酸残基Leu194、Ala230和His233分别进行定点饱和突变,得到3个优势突变体L194N(亮氨酸→天冬酰胺),A230D(丙氨酸→天冬氨酸),H233E(组氨酸→谷氨酸),然后以这3个优势突变体为模板进一步进行两点和三点复合突变,获得7个复合突变体。研究结果表明,突变体L194N/A230D/H233E以麦芽糊精为底物合成AA-2G的产量最高,达到1.95 g/L,比野生型CGT酶提高了62.5%。对获得的突变体进行动力学分析,发现高浓度的底物L-AA对突变型CGT酶催化的酶促反应具有抑制作用。确定了突变体酶促反应的最适温度、pH和反应时间。模拟突变体的三维结构并进行分析,突变体底物特异性的改善可能与CGT酶第194位、230位和233位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。

评论:塑料结合模块促进聚对苯二甲酸乙二醇酯的酶法降解

塑料的大量生产和无节制的使用已造成严重的环境污染。为了减少塑料废物对环境的影响,近年来塑料酶法降解已成为国内外研究者关注的热点。例如,通过蛋白质工程策略提高塑料降解酶催化活性和热稳定性,进一步提高酶法降解的效率。另外,通过融合酶策略将塑料结合模块与塑料降解酶融合,也可以促进塑料降解。近期发表在期刊Chem Catalysis的一项研究表明,采用碳水化合物结合模块融合策略可以在低浓度(<10 wt%)的底物聚对苯二甲酸乙二醇酯[poly(ethylene terephthalate),PET]中提高塑料降解酶的活性。但是在高浓度底物(10 wt%−20 wt%)中,该策略无法提高PET的酶法降解。该项研究对于采用塑料结合模块促进酶法降解塑料具有重要的指导意义。

谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除技术的比较

【背景】谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高,难以对其进行代谢工程改造,不利于高性能工业菌株的构建及规模生产。【目的】分别采用CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(CorynebacteriumglutamicumATCC13032)基因组上的argR和argF基因进行敲除,比较两种敲除方法的优缺点,为合理选择敲除系统提供依据。【方法】特异性重组的Cre/loxP敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP的kanR片段,然后由重组酶Cre识别loxP位点并发生重组反应,从而去除替换到基因组上的kanR片段,进一步利用质粒的温敏特性将其消除,从而实现靶基因的敲除。CRISPR-Cpf1敲除系统是利用Cpf1对pre-crRNA进行加工,形成的成熟crRNA引导Cpf1识别和结合到靶DNA的特定序列上并切割双链DNA分子,通过同源重组作用去除靶基因,基于质粒自身的温敏特性将其消除,从而完成基因敲除的整个过程。【结果】Cre/lox P系统可在8N+2 d内完成N轮迭代基因敲除,而CRISPR-Cpf1系统可在5N+2d内完成N轮迭代基因无痕敲除,理论上还可以一次对多个靶位点进行编辑,效率更高,但存在同源重组效率较低、假阳性率高等缺点。【结论】与Cre/loxP系统相比,CRISPR-Cpf1辅助的同源重组基因敲除方法可省时、省力地实现基因的无痕敲除,理论上还可实现多个基因的同时敲除、总体效率更高,然而编辑效率还有提高的空间。

环糊精葡萄糖基转移酶182位点定点改造催化合成糖基化染料木素

染料木素及其单糖苷衍物在食品和医药领域具有重要作用,但难溶于水的特性极大地限制了其应用范围,研究表明糖基化反应可有效提高其水溶性。文中针对来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶,研究其对染料木素单糖苷衍生物槐角苷的糖基化反应。通过对D182位点的定点饱和突变,突变酶D182C较WT转化率提高了13.42%,主要糖基化产物(槐角苷单糖苷、二糖苷、三糖苷)分别提高了39.35%、56.05%和64.81%。酶学性质研究发现,D182C较WT的环化、水解、歧化活力均有所提高。且最适pH和温度分别为6和40℃。动力学研究发现,D182C针对底物(糖基供体和受体)的K_(m)值较WT均有所降低,且催化效率k_(cat)/K_(m)则明显提高,说明D182C对底物的亲和力相较于WT有大幅提升。同源建模及分子对接结果表明,突变酶D182C糖基化效率提高的原因可能与底物作用力增加有关。

arcA基因提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性

【目的】将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida JUCT1)的基因arc A(编码精氨酸脱亚胺酶)整合到Escherichia coli JM109(DE3)基因组中,以提高该菌对有机溶剂的耐受性。【方法】以P.putida JUCT1的基因组为模板扩增基因arc A,并与p ET-20b(+)连接后导入E.coli JM109(DE3)中,验证该基因提高E.coli JM109(DE3)对有机溶剂的耐受性。利用Red同源重组的方法将arc A整合到E.coli JM109(DE3)基因组中。【结果】E.coli JM109(DE3)/p ET-20b(+)-arc A在添加了2.0%(体积比)环己烷、0.1%(体积比)甲苯、4.0%(体积比)萘烷和0.1%(体积比)丁醇的培养基中培养8 h后,其OD660由初始的0.2分别上升到0.8、0.9、1.8和1.3。将arc A成功整合到E.coli JM109(DE3)基因组中,获得了具有较好遗传稳定性的溶剂耐受E.coli JM109(DE3)宿主菌株。【结论】外源基因arc A能提高大肠杆菌菌株的有机溶剂耐受性,为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。