一株羊种变异布鲁氏菌分离株遗传特征分析

目的为研究一株羊种布鲁氏菌粗糙型变异菌株的遗传特征。方法本研究利用布鲁氏菌表型鉴定方法、全基因组测序及比较基因组分析方法。结果分离株与单因子R血清、三胜黄素发生凝集且能够被结晶紫染色,全基因组测序表明,该分离株与羊种2型菌株相似性最高;其基因组由2条染色体组成,大小为3311700 bp,GC含量为57.2%,含有3379个CDS,9个rRNA,55个tRNA和4个ncRNA;存在282个变异,其中243个SNPs,39个InDel;已知的LPS合成基因中,8个存在错义突变。结论基因水平上的突变导致LPS合成受阻,分离株表型由光滑型变为粗糙型。本研究为羊种布鲁氏菌粗糙型变异菌株的研究提供了基础数据,同时也为布鲁氏菌疫苗候选株的筛选提供新思路。

湖北省随州市2016年3例布鲁氏菌病流行病学调查及菌株鉴定

目的对湖北省随州市就诊的3例疑似布鲁氏菌病(布病)患者进行个案调查,并对分离的3株疑似布鲁氏菌鉴定分型。方法应用布病流行病学调查表进行现场调查,采用布鲁氏菌常规鉴定分型方法和噬菌体裂解试验进行检测,并比较BCSP31-PCR法(以布鲁氏菌属特异基因BCSP31为靶基因的检测方法)、AMOS-PCR(根据电泳条带鉴别布鲁氏菌牛种1、2、4型、羊种布鲁氏菌、猪种l型、绵羊附睾种)及实时荧光定量PCR 3种分子分型种型鉴定方法。结果 3例患者均由密切接触病畜及其肉制品感染,常规检测方法鉴定为羊种布鲁氏菌3型,多种PCR方法检测获得同样结果。结论经常规和PCR鉴定分型研究确定,随州市布病病例分离株为羊种布鲁氏菌3型。

截短的BabA蛋白结合区(C51)具有促进幽门螺杆菌AGS细胞黏附作用

目的获得能与Lewis b结合的截短的BabA结合域,并评价其对幽门螺杆菌黏附人胃腺癌上皮细胞系(AGS细胞)的影响。方法采用Swiss Model分析蛋白截短后的结构变化,克隆表达截短的BabA结合区蛋白,命名为C51,用Native-PAGE蛋白电泳法检测其是否为多聚体。用流式细胞术检测C51蛋白对J99和M523两株幽门螺杆菌黏附AGS细胞的影响,并用革兰染色观察C51蛋白对幽门螺杆菌聚集的影响。结果体外表达的C51蛋白以多聚体形式存在,该蛋白促进了J99和M523的聚集并使其与AGS的黏附分别增加了12%(t=8.211,P=0.001)和22%(t=4.402,P=0.012)。结论C51蛋白仍保持了与黏附相关的空间结构,并促进了幽门螺杆菌和AGS细胞的结合。

两种方法提取布鲁氏菌脂多糖的比较

目的比较酚水法和试剂盒法提取布鲁氏菌脂多糖的效果。方法用酚水法和试剂盒法分别提取羊种布鲁氏菌标准株16M的脂多糖,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和银染方法比较脂多糖纯度和结构的差异。用ELISA法定量测定脂多糖浓度,稀释至相同浓度后通过鲎试剂凝集试验检测并比较脂多糖的凝集活性,并从操作过程等方面对两种方法进行比较。用SAS 9.3软件对所得数据进行统计分析,两组均数之间的比较,两组方差齐用Student t检验;若组间方差不齐,则使用调整的t′检验,以α=0.05进行统计学检验。结果酚水法和试剂盒法提取的脂多糖纯度均较高,二者的鲎试剂凝集活性分别为(4.926±0.051)和(5.015±0.037)EU/ng,差异无统计学意义(t′=1.270,P=0.332)。酚水法提取的脂多糖在17×10~3及26×10~3处存在缺失,而试剂盒法提取的脂多糖结构更加完整,过程也更加安全方便。结论试剂盒法提取布鲁氏菌脂多糖比酚水法更具有优势。

羊种布鲁菌强毒株和弱毒株对巨噬细胞影响的比较

目的 研究毒力不同的两种光滑型羊种布鲁菌在巨噬细胞内存活及诱导细胞因子能力的差异，建立体外布鲁菌毒力检测方法。方法 建立羊种布鲁菌强毒株16M和弱毒株M5侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞模型，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测布鲁菌侵染后4、8、24 h，RAW264.7细胞上清培养液中白细胞介素（IL）-1β、IL-6和IL-12的表达水平；涂平板计数法检测布鲁菌侵染后2、4、8、24、48 h，RAW264.7细胞内布鲁菌的数量变化。结果 与对照组［（35.375 ± 1.132）、（35.907 ± 1.025）ng／L］比较，布鲁菌16M和M5侵染组在4 h［（41.896 ± 0.575）、（38.561 ± 0.305）ng／L］、8 h［（38.943 ± 0.097）、（38.159 ± 0.236）ng／L）时IL-6的表达量明显增加（P均 〈 0.05）；与对照组［（341.365 ± 14.672）、（382.235 ± 11.151）ng／L］比较，布鲁菌16M和M5侵染组在4 h［（414.865 ± 4.844）、（447.035 ± 12.409）ng／L］和8 h［（435.445 ± 3.684）、（453.594 ± 4.942）ng／L］时IL-12的表达量明显增加（P均 〈 0.05）。且在侵染4 h时，16M侵染组IL-6的表达量明显高于M5侵染组（P 〈 0.05）。各侵染时间IL-1β的表达量组间比较差异无统计学意义（P均 〉 0.05）。布鲁菌16M和M5侵入细胞的数量无明显差别，但16M在细胞内存活及复制增殖的能力明显强于M5。结论 布鲁菌16M在RAW264.7细胞内的存活能力强于M5，通过测量不同布鲁菌在细胞内存活情况来鉴别其毒力强弱的方法具有可行性。

低温冻存对幽门螺杆菌阿莫西林耐药表型的影响分析

目的探讨低温冻存对耐阿莫西林(AMX)的幽门螺杆菌(Hp)阿莫西林耐药表型(AMXR)稳定性的影响。方法以国际标准菌株ATCC 43504及11株中国临床分离株作为出发菌株,经体外压力筛选传代50~60代后成功诱导AMXR,检测其最小抑菌浓度(MIC)。将获得的耐药克隆置-80℃冻存1~3个月后再复苏,比较冻存前后MIC的变化。药敏试验重复2~3次。结果共得到46个AMXR克隆(MIC≥0.5μg/ml)。经-80℃冻存后,其中19个(41.3%)克隆耐药水平显著下降,MIC变化最大者下降率在98%以上。这一变化在各地分离株具有普遍性,在不同耐药水平菌株之间具有差异性。结论AMXR耐药Hp经低温冻存后耐药性下降,且这一现象在高耐药菌株尤为明显。提示在临床上以冻存标本进行的Hp分离培养中,可能存在AMX耐药率和耐药水平的低估。

患者胃窦黏膜组织幽门螺杆菌real time-PCR检测与分离培养结果的一致性分析

目的针对胃黏膜组织标本的幽门螺杆菌(HP)感染诊断的real time-PCR检测和分离培养2种最常用方法进行结果一致性分析,为HP感染诊断方法的选择提供科学依据。方法在浙江省4个地区(萧山、温岭、苍南和湖州)各选取1所医院,采集2020年11月16日至12月7日送至杭州致远检验医学研究所进行HP分离培养和耐药性分析的全部患者胃窦部黏膜活检标本,共1312份。每份样本经研磨匀浆处理后分为2份,分别用于常规HP分离培养和real time-PCR检测(以cagH为检测靶点),2种方法平行双盲进行。检测结果的一致性及不同医院来源样本间的差异用χ^(2)检验、Fisher精确检验以及独立样本t检验等统计学方法进行分析。结果1312份样本中,分离培养法和real time-PCR法的阳性率分别为29.34%(385/1312)、28.51%(374/1312),差异无统计学意义(P=0.636)。来自4所医院的标本,2种方法的检出率差异均无统计学意义(P=0.075),二者在萧山某院、温岭某院、苍南某院、湖州某院样本以及总体样本中的Kappa值分别为0.84、0.89、0.75、0.91、0.85。real time-PCR法的灵敏度和特异度分别为89.26%、100.00%。在real time-PCR法检测阳性而培养阴性的样本中,检测Ct值为25.47~34.97,均值为30.90,90%的Ct值均≤34.46,频数最高组为29.00~30.00组。结论分离培养法和real time-PCR法在临床胃黏膜标本HP诊断中均可达到较高的检测效能,且2种方法检出结果一致性良好,可应用于HP个体化治疗,以便在做出HP感染诊断的同时提供受检者的药敏检测结果。标本中HP菌量及标本的保存运输条件可能对结果产生重要影响。