骨质疏松视野下骨脂代谢相关调控网络的研究

骨髓间充质干细胞作为多能干细胞的一种,在骨髓微环境中可主要分化为成骨细胞、脂肪细胞等,而这种成骨和成脂分化之间的相互制约和交互关系可被归纳为骨脂平衡,并且这种动态平衡对骨稳态的维持起着至关重要的作用。在骨脂交互作用的过程中,骨髓脂肪组织是沟通其信号的重要载体和关键途径,并介导着骨髓微环境中的多种代谢调控过程。近年来,随着研究人员对骨脂代谢方面研究的深入,其防治骨质疏松的相关调控网络逐渐得到揭示,但是目前对于在生理病理条件下骨脂分化状态及其分子机制仍缺少系统阐释。因此,本文拟通过总结相关文献并结合我们的研究,在明确骨髓微环境视野下骨脂平衡相关概念的基础上,深入剖析其分子机制,以便为骨质疏松症的防治提供新思路。

蒙药那仁满都拉调控Wnt/β-catenin信号通路抗骨质疏松的作用及机制

目的观察蒙药那仁满都拉对去卵巢骨质疏松模型大鼠骨微结构与骨形成的影响,初步探讨其防治骨质疏松的作用及机制。方法将30只雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、蒙药那仁满都拉低、中、高剂量组,每组6只,利用去卵巢大鼠构建骨质疏松模型大鼠,模型制备成功后用蒙药灌胃,假手术组用相同体积的生理盐水灌胃。连续12周后,通过对股骨组织进行Micro-CT、骨骼力学检测、HE染色,分别观察大鼠骨密度、骨骼力度、骨组织病理形态,检测Wnt、β-catenin蛋白表达情况;从1日龄大鼠颅骨中提取成骨细胞用低、中、高浓度的含药血清干预后检测ALP染色、矿化染色,观察其ALP分泌、矿化结节大小,检测Wnt、β-catenin蛋白表达情况。结果在模型大鼠股骨组织中Micro-CT显示,蒙药组均能增加骨小梁密度;骨骼力学分析显示,蒙药组均能提高骨骼力学的载荷与刚度,其中中、高剂量组具有显著统计学意义(P<0.01,P<0.05)。HE染色结果显示蒙药组均可明显改善骨小梁病理变化;Western blot结果提示蒙药组中Wnt、β-catenin蛋白表达明显升高(P<0.0001);蒙药含药血清组均能促进成骨细胞碱性磷酸酶分泌,矿化结节形成和Wnt、β-catenin蛋白表达(P<0.0001)。结论蒙药那仁满都拉可以改善去卵巢骨质疏松模型大鼠的骨微结构,其发挥抗骨质疏松作用可能与调节Wnt/β-catenin信号通路有关。

基于网络药理学及体内实验探讨温肾通络止痛方对原发性骨质疏松症小鼠MAPK信号通路的调节作用

目的:采用网络药理学和体内实验验证的方法探讨温肾通络止痛方治疗原发性骨质疏松症的潜在作用机制。方法:选择TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM与OMIM、GeneCards数据库筛选温肾通络止痛方治疗原发性骨质疏松症的有效活性成分及靶标基因;利用Cytoscape 3.7.2建立其网络关系图;通过STRING在线分析平台构建PPI网络并运用NetworkAnalyzer拓扑学分析进一步筛选核心靶点;借助DAVID进行GO和KEGG富集分析,筛选具有统计学差异的GO过程与KEGG通路(P<0.05)。以去卵巢的方式建立原发性骨质疏松症模型,21只SPF级C57BL/6J雌性小鼠随机分为假手术组、模型组、温肾通络止痛方组,假手术组切除卵巢周围相等质量的脂肪组织,模型组和温肾通络止痛方组切除双侧卵巢;灌胃相应药物8周后,苏木素-伊红(HE)染色观察股骨组织形态学变化,酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组小鼠血清IL-6、TNF-α的表达水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)检测IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA的表达水平,蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测p-ERK、ERK、p-JNK、JNK的蛋白表达。结果:网络药理学方法筛选出温肾通络止痛方防治原发性骨质疏松症的有效活性成分包括山柰酚、槲皮素、木犀草素等203个,靶标基因包括IL-6、TNF-α、MAPK8等154个。KEGG富集分析预测温肾通络止痛方主要通过PI3K/Akt、TNF、MAPK等信号通路发挥抗骨质疏松作用。HE染色结果显示,与假手术组比较,模型组小鼠骨小梁稀疏,骨髓腔间隙较大,温肾通络止痛方可改善模型小鼠骨小梁密度,减小骨髓腔间隙。与模型组比较,温肾通络止痛方能够降低模型小鼠血清中IL-6、TNF-α的表达水平(P<0.01),降低IL-6、TNF-αmRNA表达(P<0.01),升高Runx2的mRNA的表达(P<0.01),并同时降低p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:温肾通络止痛方治疗原发性骨质疏松症具有多成分、多靶点、多途径的特点,可能通过IL-6、TNF-α靶点调控MAPK信号通路影响炎症反应等来发挥防治原发性骨质疏松症的作用。

温肾通络止痛方调控巨噬细胞极化对破骨细胞分化的影响

目的观察温肾通络止痛方对巨噬细胞极化的作用,探讨其对破骨细胞分化的影响。方法利用脂多糖建立炎性巨噬细胞模型,小鼠骨髓单核细胞体外建立破骨细胞诱导模型。通过CCK8法检测不同浓度温肾通络止痛方冻干粉对巨噬细胞增殖的影响。将实验分为正常组、模型组、中药组,通过ELISA检测巨噬细胞培养基上清中IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-10的表达,利用蛋白免疫印迹法检测NF-κB信号通路相关蛋白及INOS、TNF-α蛋白的表达。采用TRAP染色及F-actin免疫荧光检测温肾通络止痛方对破骨细胞分化的影响。结果CCK8结果显示温肾通络止痛方冻干粉48h 125μg/mL对巨噬细胞的增殖效果最好(P<0.01)。酶联免疫法检测结果表明,与正常组比较,模型组巨噬细胞上清液中IL-6、TNF-α的表达升高,IL-10、TGF-β的表达降低;经温肾通络止痛方干预后IL-6、TNF-α的表达降低,IL-10、TGF-β的表达升高,且各组间差异具有统计学意义(P<0.01)。蛋白免疫印迹法结果表明,与正常组比较,模型组中p-p65/p65、TNF-α、INOS蛋白表达升高(P<0.01),IκBα的表达降低(P<0.01),与模型组比较,中药组中p-p65/p65、TNFα(P<0.01)、INOS(P<0.01)的蛋白表达降低,IκBα的表达升高(P<0.05)。TRAP和F-actin检测结果显示,各中药组均能减少破骨细胞数目,减小F-actin环面积,并减少环的数目,且各组之间差异具有统计学意义(P<0.01)。结论温肾通络止痛方可能通过抑制NF-κB信号通路的相关蛋白的表达,抑制巨噬细胞M1极化,从而抑制破骨细胞的分化。

温肾通络止痛方对炎性骨丢失小鼠MAPK信号通路的影响

目的:观察温肾通络止痛方对炎性骨丢失小鼠骨微结构和骨吸收的影响,探讨其抗炎性骨丢失的作用机制。方法:将50只小鼠随机分为正常组,模型组,阿仑膦酸钠组,温肾通络止痛方低、高剂量组,每组10只。腹腔注射脂多糖(5 mg/kg,1次/周)构建小鼠炎性骨丢失模型。采用HE和Micro CT方法观察股骨结构,ELISA法检测血清中IL-6、IL-1β、ALP、TRAP的表达量,RT-PCR法检测胫骨组织中NFATC1、CTSK mRNA的表达,Western blot法检测胫骨组织中JNK、ERK、p38、NFATC1、CTSK蛋白表达。结果:与模型组比较,温肾通络止痛方高、低剂量组均可改善骨小梁密度,减小骨髓腔间隙,缓解小鼠骨质流失;增加3D BMD、BV/TV、Tb.Th,降低Tb.Sp;降低血清中IL-1β、IL-6、ALP、TRAP的表达(P<0.01);降低NFATC1、CTSK mRNA的表达水平(P<0.05),并抑制NFATC1、CTSK、p38、ERK、JNK蛋白表达(P<0.01)。结论:温肾通络止痛方能够显著改善炎性介导的小鼠骨质流失,其作用机制可能与MAPK信号通路有关。