豆状带绦虫TPO18基因的原核表达及保护性分析

【目的】明确重组蛋白pGEX-TPO18的免疫保护效果。【方法】提取豆状带绦虫六钩蚴RNA,根据带科其他种属绦虫18 kD基因的保守区设计引物,5′端分别引入EcoR I、Xho I限制性酶切位点,RT-PCR扩增,产物克隆于pMD18-T中进行序列测定,并对序列进行生物信息学分析。将纯化后的PCR产物和质粒pGEX-4T-1分别用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切,回收目的片段,连接后转化至E.coli BL21感受态细胞,挑斑摇菌,通过PCR方法和重组质粒测序技术进行鉴定,将鉴定正确的重组表达质粒命名为pGEX-TPO18。用IPTG诱导表达重组质粒,收集菌体进行SDS-PAGE分析,用GST琼脂糖树脂纯化TPO18蛋白,进行Western blottting检测。将纯化后的重组蛋白分别乳化弗氏佐剂、206佐剂、氢氧化铝佐剂后免疫家兔,每次50μg/只,共免疫3次,末次免疫后34 d每只家兔感染1 500个虫卵,感染58 d后扑杀并计算各免疫组减囊率。免疫前后每隔7 d采血分离血清,ELISA法检测血清抗体水平,以40μg·mL-1重组蛋白包被酶标板,血清1﹕200稀释,检测血清样品的OD492nm值。【结果】TPO18基因的RT-PCR扩增产物为339 bp,与预期大小相符;测序结果表明无碱基突变,重组质粒pGEX-TPO18构建成功。pGEX-TPO18在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物为38.6 kD的可溶性蛋白,Western blotting分析结果显示兔抗豆状囊尾蚴阳性血清与重组蛋白在38.6 kD处有一条明显的反应条带,表明该重组蛋白具有反应原性。经ELISA检测,免疫后7 d免疫组家兔抗体水平开始升高,第43天达到峰值。经口感染虫卵后,免疫组抗体水平开始降低,但仍保持一定水平。家兔免疫保护试验表明弗氏佐剂、206佐剂和氢氧化铝佐剂免疫组减囊率分别为79.13%、65.66%和50.43%。【结论】研究表明弗氏佐剂免疫效果较好,有望研制出抗豆状囊尾蚴病的高效疫苗。

人工感染犬多头多头绦虫组织结构的观察

目的观察人工感染家犬肠道中多头多头绦虫（Multiceps multiceps）的显微和超微结构。方法收集自然感染的羊脑多头蚴,分别经口感染2只6月龄雄性家犬（80~100个/只）。感染后67 d,取家犬肠道中多头多头绦虫成虫,常规方法固定后,分离多头多头绦虫的头节、颈节、成熟节片和未成熟节片,制备石蜡切片和电镜超薄切片,分别进行苏木素-伊红（HE）染色和醋酸双氧铀染色后,用光学显微镜和透射电镜观察。结果光镜下见多头多头绦虫成虫各节片均可分为皮质层和髓质层。电镜下皮质层的基本结构为绒毛、合胞体和基质,髓质层主要为肌肉组织,以排泄系统、生殖系统为主。头节的绒毛层比颈节、成节的薄,绒毛最长的部位主要分布在节片的结合部位。头节部位肌肉组织发达。神经系统和排泄系统见于各节片。成熟节片有雌性、雄性生殖器官各一套。孕卵节片中的雄性生殖器官萎缩,主要以子宫和虫卵为主。结论多头多头绦虫显微结构的特别之处在于皮质部位的绒毛以圆柱状为主,成熟节片间的连接部位的微绒毛比成熟节片其他部位的微绒毛长。

豆状带绦虫抗原的SDS-PAGE及Western-blot分析

为筛选豆状囊尾蚴的特异性抗原,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western-blot）技术对自然感染的豆状带绦虫成虫、幼虫的头节、囊壁可溶性抗原及囊液抗原进行了分析.结果表明：从豆状带绦虫不同发育阶段的虫体中分离出5~12条主要蛋白区带,分子质量为25~114 ku.以第7周自然感染家兔血清对7种虫体抗原进行的Western-blot分析显示,7种虫体抗原在42、57、63 ku处均能被兔抗豆状囊尾蚴血清识别.以家兔阳性血清中提取出来的 IgG免疫球蛋白对 7种虫体抗原进行的 Western-blot分析显示,7种虫体抗原在63 ku处均能被兔抗豆状囊尾蚴血清识别.说明63 ku蛋白带可作为预防兔豆状囊尾蚴病的候选疫苗抗原.试验初步阐明了豆状带绦虫 7种不同抗原的部分生化特性,为对该抗原的进一步深入研究奠定了基础.

豆状带绦虫线粒体rrnL和nad5基因的克隆及种系发育研究

本研究旨在阐明中国豆状带绦虫囊尾蚴河南分离株线粒体核糖体大亚基基因(rrnL)部分序列(prrnL)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)部分序列(pnad5)的遗传变异情况,并用prrnL和pnad5序列重构豆状带绦虫与其他带科绦虫的种系发育关系。采用聚合酶链式反应(PCR),扩增豆状带绦虫囊尾蚴分离株的线粒体prrnL和pnad5,将所测的序列用PAUP 4.0Beta 10程序MP法绘制种系发育树,利用DNAStar 5.0中的MegAlign程序进行同源性分析。所获得的豆状带绦虫线粒体prrnL长度约为847bp,pnad5为602bp。所获rrnL序列与GenBank中豆状带绦虫相应序列的相似性为99.1%～100%,nad5为99.2%～100%;河南分离株之间rrnL序列的相似性为99.65%,nad5为99.5%;与GenBank中其他带科绦虫序列的相似度rrnL低于83.4%,nad5低于85.7%。种系发育分析结果表明,所有豆状带绦虫分离株和已知豆状带绦虫位于同一分支。由于豆状带绦虫分离株的线粒体rrnL和nad5基因序列种内很保守,种间差异较大,故可作为带科绦虫种间遗传变异研究的标记。

豆状带绦虫不同发育阶段虫体的抗原特性分析

为了解豆状带绦虫成虫、幼虫及虫卵的蛋白组分及其之间的差异,比较分析其免疫反应性,应用SDS-PAGE从豆状带绦虫不同发育阶段的虫体中分离出4～8条主要蛋白区带,分子质量为30.4～114.9ku。取人工感染豆状带绦虫犬自然排出的孕卵节片,虫卵计数后以不同数量虫卵感染家兔,定期采血,用间接ELISA法检测家兔的抗体变化情况。结果显示,家兔自感染后第2周抗体水平开始升高,第7周开始逐渐下降。以第7周感染家兔血清对13种虫体抗原进行的Western-blot分析显示,13种虫体抗原在59.4ku处均能被兔抗豆状囊尾蚴血清识别,羊脑多头蚴与豆状囊尾蚴共有4条相似带,分子质量分别为32.7、59.4、78.7、81.1ku,特异性抗原极相似,表明虫种之间存在着强烈的交叉反应,59.4ku蛋白带很有希望成为预防兔豆状囊尾蚴病的候选抗原。

羊脑多头蚴的超微结构观察

为观察羊脑多头蚴的超微结构,寻找自然感染羊脑多头蚴的病羊,采集多头带绦虫续绦期幼虫,固定于25mL/L戊二醛中,分别取其头节、囊壁、颈部区,超薄切片后进行透射电镜观察。结果表明,羊脑多头蚴的囊壁结构具有微毛,远离头节的囊壁微毛与头节附近颈部区囊壁的微毛分布情况不同;囊壁可明显分为皮层、间质层、实质区;在实质区可观察到皮层细胞、实质细胞、成石灰小体细胞、焰细胞、成肌细胞以及排泄系统结构;头节中可观察到很发达的肌纤维结构,头节内部有类似于囊壁的皮层结构,并可见粗大微毛,细胞种类明显少于囊壁实质区,含颗粒的囊泡结构明显增多。证明羊脑多头蚴囊壁的结构和细胞种类与其他绦虫相似,但有比较发达的排泄系统;头节外表面无皮层结构,仅有呈环状围绕的纤维和囊泡结构。