小鼠热休克蛋白gp96羧基端片段的克隆、表达及纯化

热休克蛋白 (Heatshockprotein )gp96 (Grp94 )是近年来新发现的一类糖蛋白 ,除了分子伴侣的功能外 ,现有越来越多的文献报道了它在先天性免疫和获得性免疫中的重要作用。gp96可以促进抗原呈递细胞的成熟以及细胞因子的分泌。热休克蛋白抗原肽复合体可以引起特异性的细胞毒T淋巴细胞效应 ,应用这个特点可以设计抗病毒及抗肿瘤药物[1 ] 。但是gp96全长分子量大 ,蛋白在大肠杆菌中表达量低 ,不稳定 ,难纯化。组织提取的gp96又受组织来源和样品量的限制。对gp96的结构和功能的研究带来困难。克隆并表达了小鼠热休克蛋白gp96的羧基端 5 6 0 75 1aa约四分之一长的功能片段 ,该段包含gp96的一个肽结合区和二聚化位点[2 ] 。将该功能片段在大肠杆菌中进行融合表达 ,纯化后将融合的片段切掉 ,并对目的片段进行了分析 ,结果表明该段可能是形成二聚体密切相关的片段 。

简析仪表自动化在化工工业方面的应用

市场经济的快速发展带动了化工工业的发展,我国的化工行业对仪表自动化的应用越来越广泛,仪表本身就是化学工业中最重要的一部分,仪表自动化程度的提高,大大提高了仪表的工作效率,推动着化学工业的不断发展与进步。仪表自动化在化工工业方面的应用,有利于提高化工工业的科学技术水平,提高生产效率。

水痘-带状疱疹病毒抗原的ELISA定量检测方法的建立

目的:建立水痘-带状疱疹病毒(VZV)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于质控VZV灭活疫苗研发和生产中抗原含量。方法:以VZV中和单抗5F6C8为包被抗体、8H5D1为酶标抗体,构建定量检测VZV抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对本方法的特异性、灵敏度、准确性、线性和稳定性等性能进行分析。结果:建立的双抗体夹心定量检测VZV抗原的ELISA方法,线性范围为0.4μg～13μg/ml,相关系数为R2=0.994,定量限度为0.4μg/ml;变异系数CV<15%、准确性回收率介于87.5%～111.6%之间,稳定性37℃6天的回收率>80%。与VZV以外的相关病毒样本没有交叉反应。结论:构建的VZV抗原ELISA定量检测方法的各项性能符合定量检测需要,可用于VZV灭活疫苗的研发和生产过程的抗原含量检测。

柯萨奇病毒A组16型抗原的ELISA定量检测方法建立

目的:建立柯萨奇病毒A组16型(CA16)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于CA16灭活疫苗的研发和生产过程的抗原定量检测。方法:以CA16中和单抗T26H12为包被抗体、NA14B9为标酶抗体,构建定量检测CA16抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对方法的特异性、灵敏度、精密度、准确性、线性和稳定性进行分析。结果:建立了双抗体夹心定量检测CA16抗原的ELISA方法。方法的线性相关系数R2=0.998,线性范围为8～128 ng/ml,定量限度为8 ng/ml;变异系数CV<15%;回收率介于87.0%～113.8%之间;37℃6天的回收率>80%;与CA16以外的其他样本没有交叉反应。结论:构建的CA16抗原ELISA定量检测方法的各项性能符合定量检测需要,可用于CA16疫苗的研发和生产过程的抗原活性的定量检测。

柯萨奇病毒A组16型疫苗免疫后中和抗体检测方法的比较

目的采用3种方法检测灭活的柯萨奇病毒A组16型(CA16)疫苗的免疫保护性抗体水平,旨在构建评价疫苗免疫保护的检测平台。方法 CA16候选株疫苗(3726,4430和4432)按0、4、6、8周,经腹腔接种小鼠、大鼠和豚鼠,采集0、4、6、8周和10周血样。通过竞争抑制ELISA、细胞微孔病变实验和乳鼠攻毒保护实验评估免疫血清中和抗体水平,利用SPSS16.0软件分析3种检测方法相关性。结果血清中和抗体在首次加强免疫2周后达到峰值;竞争抑制ELISA和细胞微孔病变实验测得中和效价的相关系数为0.861;竞争抑制ELISA和乳鼠攻毒保护的相关系数为0.8;细胞微孔病变实验和乳鼠攻毒保护的相关系数为0.89。结论竞争抑制ELISA检测中和抗体与"金标准"相比具有灵敏、快速、大量、低廉等特点,具有广阔的应用前景。

人丙氨酸氨基转移酶基因(ALT1)的克隆、表达、纯化及酶活性的鉴定

目的克隆、表达、纯化重组人丙氨酸氨基转移酶(ALT1),并测定该酶活性,为建立特异性的ALT分型检测方法奠定基础。方法通过RT-PCR从肝癌细胞中扩增丙氨酸氨基转移酶(ALT1)基因,并将其克隆至pET-28 a表达载体中。重组表达质粒pET28 a-ALT1,转化大肠杆菌BL21,经1.0mmol.L-1IPTG诱导,表达可溶性重组融合蛋白,通过硫酸铵沉淀、镍离子柱亲和色谱及QHP柱色谱3步纯化,并检测融合蛋白活性。结果经过表达条件的优化增加了可溶性蛋白的表达,纯化后目的蛋白纯度达到85%,经测定重组蛋白具有很高的丙氨酸氨基转移酶活性(200 U.mg-1)。结论通过基因克隆及大肠杆菌表达,能得到活性较高的丙氨酸氨基转移酶蛋白。

带状疱疹减毒活疫苗免疫大鼠体外IFN-γ释放检测平台的建立

目的探索并建立带状疱疹减毒活疫苗免疫大鼠脾细胞的体外IFN-γ释放检测方法 ,并建立评价带状疱疹疫苗免疫应答的检测平台。方法取雌性SD大鼠免疫后4、6、8、12周的血清及脾细胞,分别用gp-ELISA法定量检测血清IgG水平,用双抗体夹心ELISA法定量检测脾细胞体外IFN-γ释放水平,用SPSS 16.0软件分析检测数据。结果大鼠IFN-γ释放受到脾细胞数、培养时间、刺激物种类的影响,脾细胞数为1×107个/ml、用带状疱疹疫苗刺激6 d的IFN-γ释放量[(6 617±1.33)pg/ml]达到峰值,协同刺激因子可加速脾细胞体外IFN-γ释放速度,刺激2 d后IFN-γ释放量[(6 016±1.46)pg/ml]达到峰值,与疫苗单独刺激组6 d的峰值水平一致。大鼠免疫后血清IgG水平与脾细胞释放的IFN-γ水平随带状疱疹疫苗免疫次数增加的变化趋势一致,皆于第2次免疫后达到峰值期。结论通过对影响带状疱疹疫苗免疫大鼠脾细胞体外IFN-γ释放因素的研究,建立了大鼠脾细胞体外IFN-γ释放检测平台,且发现协同刺激因子可加速而不额外增加脾细胞体外IFN-γ释放量,为快速检测大鼠脾细胞体外IFN-γ释放量提供了方法;同时验证了gp-ELISA检测的IgG与双抗体夹心检测的IFN-γ具有一致性。

Ⅰ型单纯疱疹病毒单克隆抗体的制备及其应用

目的：制备并筛选HSV-1单抗,建立定量检测HSV-1病毒颗粒抗原的双抗体夹心ELISA方法,用于HSV-1病毒颗粒的质控。方法：以HSV-1免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,以筛选的中和单克隆抗体1F6为捕捉抗体,HRP标记的2B1为检测抗体,构建定量检测HSV-1病毒颗粒抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对本方法的特异性、灵敏度、精密度、准确性和线性等性能进行验证。用本方法定量检测的病毒量与病毒滴度作回归分析。结果：构建的双抗体夹心定量检测HSV-1病毒颗粒抗原的ELISA方法,线性范围为0.125~2μg/ml,相关系数为R2=0.995 5,定量限度为0.125μg/ml,试剂的变异系数CV〈10%,抗原回收率介于85.6%~107.1%之间。与HSV-1以外的其他样本无交叉反应。本方法检测与病毒感染滴度具有很好的相关性。结论：成功构建了定量检测HSV-1含量的ELISA方法,为HSV-1病毒颗粒抗原定量检测提供快速手段。

蛋白酶K单抗研制及其双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

目的研制蛋白酶K单克隆抗体并构建定量检测蛋白酶K的双抗体夹心ELISA方法 ,用于生物制品中蛋白酶K的检测。方法用杂交瘤技术制备抗蛋白酶K的单抗,用棋盘法优化ELISA条件,建立定量检测蛋白酶K的双抗体夹心ELISA方法,分析其特异性、精密性和准确性。结果经免疫、融合、克隆、筛选到稳定分泌蛋白酶K单抗的杂交瘤细胞。获得1株阻断蛋白酶K活性的单抗5G6,以5G6为包被抗体、4D3为酶标抗体,构建蛋白酶K定量检测的ELISA方法。本方法线性相关系数R=0.99,线性范围为293.4-2 500 pg/ml;定量限度为293.4 pg/ml;变异系数为CV〈15%;回收率介于89.3%-129.2%之间,37℃6 d的回收率〉80%;与蛋白酶K以外的其他蛋白无交叉反应。结论获得阻断蛋白酶K活性的单抗,构建出灵敏、特异的蛋白酶K定量检测方法。

柯萨奇病毒A组16型中和抗体检测方法的实验室评价

目的评价柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)中和抗体检测方法于不同实验室内和实验室间的可重复性。方法参照WHO脊髓灰质炎病毒中和抗体检测方法,建立CA16中和抗体检测方法和实验标准;收集22份血清样品,对CA16 A基因型毒株G10及B基因型毒株W190、33、203、P11和CS02毒株独立进行CA16中和抗体有效检测实验,评价所建立的检测方法于A^G实验室内和实验室间的可重复性;分别于A、B、C、D和E实验室比较G10毒株与W190、33、203、P11和CS02毒株对CA16中和抗体检测结果的影响。结果在各实验室内,有17/22份血清样品的变异系数(variable coefficient,CV)在0~11.4%之间,表明该检测方法在同一实验室内具有较好的可重复性;在实验室间,除3份低效价血清和1份效价过高血清外,其余血清样品的几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)最大差异倍数均在3.0倍以内,实验室间检测差异在可接受范围内;W190、33、203、P11和CS02毒株与G10毒株检测结果趋势相近。在同一实验室内,W190和33毒株与G10毒株的检测结果差异无统计学意义;203、P11和CS02毒株的检测结果均低于G10毒株,差异有统计学意义,表明B基因型毒株与A基因型毒株生物学活性存在一定差异。结论以G10毒株检测CA16中和抗体的方法在各协作实验室可得到良好应用,有利于CA16中和抗体检测的标准化,但适用性需进一步评估和验证。

肠道病毒71抗原ELISA检测方法构建及其应用

目的 建立肠道病毒71型（EV71）抗原的ELISA检测方法.用于EV71的抗原定量、TCID50试验及EV71免疫原性与免疫保护性的关系分析.方法 以高亲和力的EV71中和单抗K8G2和Y8H2-HRP构建检测EV71抗原的双抗体夹心ELISA方法.比较本方法与显微镜观察法检测的EV71 TCID50.分析EV71抗原的特异比活与免疫血清中和抗体水平的关系.结果 本试剂定量检测抗原的线性范围为0.125 ～4.0 U/ml,R2 =0.9911,试剂不与EV71之外的受试物反应,试剂的回收率为0.89 ～ 1.16,变异系数小于15％,37℃9 d的热回收率大于85％.本法与显微镜观察法检测的EV71 TCID50的相关系数r=0.990.21株EV71抗原的特异比活与免疫血清中和抗体水平的相关系数r=0.930.结论 构建了EV71抗原ELISA检测试剂,可用于EV71的抗原含量检测、TCID50分析,为特异比活与免疫血清中和性关系研究提供了一些有价值的信息.

不同EV71毒株的免疫保护差异性研究

目的 对用MRC-5细胞分离的5株EV71疫苗候选株进行差异性研究,旨在筛选出符合疫苗制备需要的病毒株.方法 将5株单克隆化的EV71疫莳候选株制备成试验苗,腹腔接种ICR雌性小鼠,加强免疫两周后,雌雄配对,饲养2周,对雌鼠再加强免疫1次,并对出生24 h内的乳鼠进行颅腔攻毒,观察乳鼠生存状况;用ELISA法检测母鼠和乳鼠血清IgG滴度;用巢式PCR检测攻毒乳鼠肠道EV71载量;用MRC-5细胞培养法检测免疫血清对病毒的中和能力;用SPSS16.0对实验数据进行统计分析.结果 5株病毒免疫的雌鼠血清抗体水平随免疫次数增加而提高、抗体对病毒的中和能力存在差别;致死株攻毒的乳鼠存活状况存在差别,非致死株攻毒的乳鼠肠道EV71载量也存在差别.结论 从分子水平、细胞水平和个体水平上证实5株病毒的免疫原性和免疫保护性存在差别,123株是免疫保护力最好的一株。

一种可快速、持久且广谱保护新冠病毒感染的鼻喷减毒流感病毒载体新冠病毒疫苗

肌注式新冠病毒疫苗在呼吸道局部诱导的免疫应答较有限,不能高效阻止新冠病毒入侵呼吸道细胞.为此,该研究利用双重减毒的流感病毒载体(CA4-d NS1)开发出一种携带新冠病毒RBD基因的可经鼻腔喷雾方式接种的新冠病毒疫苗CA4-dNS1-nCoV-RBD(简称dNS1-RBD).该疫苗在重症新冠肺炎仓鼠模型中表现出良好的保护效果,鼻喷接种1天后即可快速起效,两剂次鼻喷接种后可提供9个月以上的长效保护,表现为疫苗组仓鼠的体重未见明显下降,肺组织病理无明显损伤.该疫苗对Omicron等各种新冠病毒关切突变株均有广谱作用.另外,小鼠实验显示该疫苗还可广谱保护H1N1和H5N1流感病毒感染.该疫苗的保护机制涉及呼吸道局部的先天免疫应答、特异性T细胞应答、粘膜Ig A抗体应答和体液Ig G抗体应答等.总之,该研究表明快速、持久且广谱的鼻喷流感载体新冠病毒疫苗可与现有肌注式新冠病毒疫苗形成互补,共同抗击新冠疫情.

溶瘤I型单纯疱疹病毒的研究进展

溶瘤病毒(Oncolytic virus,OV)是可以靶向感染并杀伤肿瘤细胞的一类病毒,其中溶瘤I型单纯疱疹病毒(Oncolytic herpes simplex virus type 1,OHSV-1)是目前研究最多的溶瘤病毒之一,可通过多种策略进行构建,已有多种OHSV-1进入临床试验,大量结果显示其具有较好的安全性和有效性。本文主要介绍OHSV-1的分子生物学特性与优势、主要的开发及靶向性策略、各类OHSV-1的研究进展以及目前存在的问题等。

牛血清IgG双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立及应用

目的建立牛血清Ig G(bovine immunoglobulin G,BIg G)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法。方法用BIg G-Fc免疫BALB/c小鼠,制备抗BIg G单抗,确定包被抗体及酶标抗体后,建立定量检测BIg G抗原的双抗体夹心ELISA方法,并验证该方法的准确度、精密度、稳定性、特异性,确定该方法的线性范围和定量限度。应用建立的方法检测不同厂家、不同批次牛血清及纯化EV71样品中BIg G抗原残留量。结果建立了以3E12D2为包被单抗(8.0μg/ml,100μl/孔),4A2G1B1-HRP为酶标抗体(1∶1 000稀释,100μl/孔)定量检测BIg G的双抗体夹心ELISA方法,该方法的线性范围为0.3~9.6 ng/ml,R^2>0.99,定量限度为0.3 ng/ml;回收率在94.1%~108.5%之间,同一实验者重复检测和不同实验者检测的变异系数均<10%;37℃放置3和6 d的稳定性均>90%;该试剂样品与BIg G可发生特异性反应,与其他动物源血清无交叉反应。9批牛血清中BIg G含量均存在差异;精纯样品较粗纯样品BSA和BIg G均明显去除,但BIg G占牛血清残留量(BSA+BIg G)的比例却明显上升。结论建立的BIg G抗原的双抗体夹心ELISA方法符合定量检测需要,可用于牛血清的质量质控及残留量检测。