西瓜抗枯萎病相关基因ClMYB转录因子的克隆及表达分析

【目的】克隆西瓜抗枯萎病相关基因CIMYB转录因子,进行生物信息学及表达模式分析,为进一步解析CIMYB在西瓜抗枯萎病机制中的作用提供理论依据。【方法】根据西瓜与枯萎病菌不亲和互作的抑制差减文库和Microarray数据分析,获得与西瓜抗枯萎病相关的基因CIMYB,采用RT-PCR技术分离克隆CIMYB c DNA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的保守结构域及序列特征;使用MEGA5.0对CIMYB蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;采用GFP标记的方法进行亚细胞定位,分析编码蛋白表达位置;将该基因片段通过Nde I和Xba I双酶切连接至原核表达载体p Czn1,重组质粒转化至大肠杆菌Arctic Express,经终浓度为0.5 mmol·L^(-1) IPTG诱导4 h,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在西瓜与枯萎病菌互作中及在茉莉酸(jasmonate,JA)诱导下的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从西瓜野生材料PI296341-FR根系组织中克隆该基因片段(Gen Bank:KT751229),序列比对及生物信息学分析表明,其基因编码的氨基酸序列具有MYB转录因子R2R3型的典型特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,C端高度变异。多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与甜瓜MYB(Gen Bank:XM_008440304)和黄瓜MYB(Gen Bank:XM_011652633)同源性最高,其编码的氨基酸一致性达到86%,这与它们同属葫芦科植物有关;亚细胞定位显示CIMYB定位于细胞核,为典型的转录因子;成功构建了该基因的原核表达载体p Czn1-CIMYB,转化至大肠杆菌得到36 k D左右蛋白;CIMYB受枯萎病菌诱导,在高抗枯萎病菌材料PI296341-FR中,相对感病品种表达量高峰出现的早,且表达量高。50μmol·L^(-1)的Me JA处理可以显著提高感病材料Black diamond对枯萎病的抗病水平,同时诱导CIMYB表达,与抗病材料PI296341-FR相比表达趋势一致,但表达量更高。【结论】CIMYB为典型的R2R3-MYB转录因子,亚细胞定位于细胞核中;基因的原核表达得到36 k D的融合蛋白,在西瓜中的表达受枯萎病菌和茉莉酸诱导,推测CIMYB可能参与JA介导的西瓜抗枯萎病防卫反应的信号通路,在西瓜抗病中起一定的作用。