芽胞杆菌耐受胁迫条件的机制及工业应用

芽胞杆菌作为一种极具潜力的底盘菌株,能够在多种工农业废物和极端环境中生长,也能生产出多种工业化产品,如食品、饲料、益生菌、植物生长促进剂、酶和生物活性化合物等。然而,尽管具有生产高效、成本低廉等优点,芽胞杆菌在发酵生产中依然存在几个瓶颈问题,导致其工业生产的巨大潜力难以得到充分利用。其中一个关键问题在于,发酵生产过程中的生长以及生产效率较易受到多种胁迫条件的限制,进而导致发酵生产的不彻底、不完全。因此,探究芽胞杆菌胁迫响应的影响因子及改造策略,发掘其多种代谢活动与生长性状间的联系,就可以增强芽胞杆菌的抗胁迫能力,进而提高芽胞杆菌在工业应用中的质与量。本文首先分析了芽胞杆菌的多种应激反应机制,为进一步提高芽胞杆菌胁迫耐受能力、构建一个高效生产且具有良好抗逆性能的底盘菌株,总结阐述了非理性设计筛选抗性菌株的多种策略,以及抗逆基因线路和高耐受性微生物底盘的多种构建方法。为推动芽胞杆菌胁迫耐受机制的研究及工业应用领域的拓展提供策略和思路。

基因编辑技术对大肠杆菌yjjW基因点突变的两步法策略

【目的】为了实现对大肠杆菌靶基因的点突变,本研究将同源重组系统与CRISPR-Cas9技术相结合,探索一种高效、简捷的两步法策略。【方法】将靶基因的上下游同源臂和标记基因(amp)与pKOV质粒连接,获得pKOV-HR重组质粒。将pKOV-HR转化至大肠杆菌,借助其自身RecA重组系统,介导DNA发生同源重组,获得靶基因敲除菌株。随后,靶基因的点突变采用pSGKP-km和pCasKP-apr双质粒系统。首先,设计与amp结合具有定向引导作用的spacer序列,并利用overlap PCR获得带有靶基因点突变的同源臂,将spacer和同源臂与pSGKP-km质粒连接,获得重组质粒pSGKP-km-spacer-HR;接着,将pSGKP-km-spacer-HR和pCasKP-apr质粒转化至上述敲除菌株;最后,利用质粒表达的Cas9切割蛋白和λ-Red重组蛋白,发生DNA同源重组,获得靶基因点突变菌株。【结果】利用上述方法,既成功获得了大肠杆菌yjjW敲除菌株D7ΔyjjW::ampR,又实现了yjjW第24位碱基T到C的点突变,获得点突变菌株D7yjjW-24。【结论】本研究建立了一种高效、简捷的大肠杆菌靶基因点突变方法,amp基因的插入提供了有效的筛选标记,此外该方法建立的重组质粒pSGKP-km-spacer,可应用于同种菌株其他靶基因的点突变,能够缩短后续实验操作,为基因编辑技术的发展提供了科学理论以及实验操作基础。