采用慢病毒载体干扰TRAF2表达的MH7A细胞稳转株的构建及意义

目的 用慢病毒载体构建干扰肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)表达的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞株MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号在MH7A异常增殖的作用。方法 根据人TRAF2的基因序列和shRNA序列设计原则,设计并合成3对TRAF2-shRNA干扰序列,通过PCR对引物进行退火,通过双酶切PLKO.1-puro获得线性载体,将线性化载体与退火后引物通过Solution I连接,连接产物导入感受态细胞,涂板,挑取阳性菌落进行测序。构建3种不同的PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒重组质粒,借助慢病毒包装质粒对对数生长期的HEK 293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液感染MH7A细胞,同时使用嘌呤霉素对TRAF2低表达的MH7A稳转株进行筛选。使用CCK-8法、Western blot、qPCR检测MH7A中肿瘤坏死因子TNF-α诱导TRAF2低表达的MH7A增殖功能及下游信号TRAF2、P65蛋白表达和mRNA水平。结果 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)和PLKO.1-TRAF2-shRNA(3)慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro,将3个TRAF2-shRNA慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro分别与慢病毒包装质粒导入HEK 293T获得病毒液,将病毒液感染MH7A细胞后,经嘌呤霉素(2.00μg/ml)筛选,2 d得到MH7A稳转株;qPCR和Western blot结果显示,PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株中TRAF2 mRNA和蛋白的表达较阴性对照组明显下降;CCK-8和Western blot结果表明,MH7A中TRAF2敲低后,TNF-α诱导的TRAF2低表达的MH7A细胞增殖和P65的磷酸化水平明显下降。结论 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号活化介导RA滑膜细胞异常增殖中的作用。

人源GRK2的真核表达、纯化及活性检测

目的构建人源G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)真核表达系统。方法设计引物,以pIRES-EGFP-GRK2(全长)基因为模板,PCR扩增His-GRK2目的基因,将His-GRK2目的基因连接在pcDNA3.1-EGFP真核表达载体上;将pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒转染至HEK 293T细胞,48 h后采用Western blot法检测GRK2蛋白表达,通过镍螯合的磁珠法纯化GRK2蛋白,考马斯亮蓝染色和Western blot法检测GRK2蛋白纯化,His pull down检测GRK2蛋白活性。结果双酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2真核表达质粒成功构建;Western blot法检测结果表明,GRK2蛋白的分子量约为80 ku,提示GRK2蛋白在HEK 293T细胞中成功表达(t=6.433,P=0.003);通过镍螯合的磁珠纯化得到GRK2蛋白,His pull down实验结果表明GRK2与前列腺素E2受体4亚型(EP4)结合,提示GRK2蛋白具有生物学活性(t=13.5,P=0.0002)。结论pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2真核表达质粒的序列测序正确,成功构建GRK2重组质粒,GRK2重组质粒在真核细胞HEK 293T的细胞中成功表达且表达的蛋白具有生物学活性。

不同固定液对内皮细胞形态和EP4荧光染色的影响

采用4种固定液对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)进行固定:1-20℃无水甲醇溶液;2新鲜配制4 g/L多聚甲醛溶液;3久置(≥1个月)4 g/L多聚甲醛溶液;4 3.7%甲醛溶液。观察细胞形态和前列腺素受体4(EP4)免疫荧光染色效果。结果表明3.7%甲醛溶液固定后进行免疫荧光染色显示大部分细胞维持梭形或不规则多边形,EP4荧光染色效果较佳;所以3.7%甲醛溶液固定液固定细胞20 min,HUVECs形态典型,EP4的荧光染色效果最佳。

IGF-1通过激活EGR1诱导肝细胞癌的迁移和侵袭

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)诱导肝细胞癌(HCC)迁移和侵袭的机制。方法选用两株转移潜能不同的HCC细胞株HepG2和HCCLM3,分别加入25、50和100 ng/ml的IGF-1,用transwell的方法检测细胞的迁移和侵袭;Western blot、RT-PCR和实时定量PCR法检测胞内信号通路的活化和早期生长反应蛋白1(EGR1)的表达;转染EGR1的siRNA抑制其表达,观察IGF-1对HCC细胞株的迁移和侵袭的影响。结果IGF-1可浓度依赖地促进HCC细胞株的迁移和侵袭,IGF-1增加HCC细胞株中IGF1R、Akt及ERK的磷酸化水平,而对总表达无明显改变,同时EGR1的蛋白和mRNA表达也随着IGF-1的浓度增高而增加,转染EGR1的siRNA降低其表达后,IGF-1对细胞的迁移侵袭能力明显减弱。结论IGF-1诱导HCC细胞株的迁移和侵袭作用是由EGR1所介导的。

亲社会视频游戏对大学生内隐攻击性和内隐自尊的影响

为探讨亲社会视频游戏对大学生内隐攻击性和内隐自尊的影响,以130名具有中等游戏经验的在校大学生为被试,采用单因素随机实验设计,分别玩亲社会视频游戏或中性游戏15 min后,采用内隐联想测验测量内隐攻击性和内隐自尊.结果显示:亲社会视频游戏组被试的内隐攻击性水平显著低于中性游戏组,内隐自尊水平显著高于中性游戏组.也就是说,短时接触亲社会视频游戏能够降低大学生的内隐攻击性、提高内隐自尊水平.

荧光共振能量转移法对细胞cAMP含量的实时检测

大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)转染pc DNA3-ICUE3质粒,用荧光共振能量转移(FRET)法观察前列腺素(PGE2)刺激下大鼠FLS环磷酸腺苷(c AMP)水平的实时变化,与放免法检测进行比较。FRET检测到FLS在PGE2刺激后1 min,c AMP升高14.93%,且不同批次实验差异较小;放免法检测到c AMP升高7.79%;FRET可检测到PGE2受体拮抗剂对c AMP产生的抑制,可观察到1 nmol/L PGE2促进c AMP产生,放免法检测PGE2产生效应最低浓度为0.1μmol/L。提示FRET法检测灵敏、重复性高,为G蛋白偶联受体信号通路研究的可靠技术手段。

pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒真核表达载体的构建与表达

GRK2-S670A突变体导入pI RES-EGFP真核表达载体,为寻找GRK2磷酸化GPCR的位点提供研究基础。利用PCR定点突变试剂盒,获得pG EM-T-GRK2-S670A,用Sal I/Apa I分别对pG EM-T-GRK2-S670A和EGFP-C3双酶切,构建EGFP-C3-GRK2-S670A,Sal I/BamH I双酶切EGFP-C3-GRK2-S670A和pI RES-EGFP,得到pI RES-EGFP-GRK2-S670A。将构建的质粒转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察和Western blot法检测融合蛋白的表达。酶切鉴定显示pI RES-EGFP-GRK2-S670A质粒条带大小符合,测序结果正确,成功构建pI RES-EGFP-GRK2-S670A真核表达质粒,转染HEK293细胞后可见融合蛋白表达,为后续研究奠定基础。

学习焦虑对高一新生适应不良的影响:人际关系敏感的中介作用

探讨学习焦虑对高一新生适应不良的影响以及人际关系敏感的中介效应。采用心理健康诊断测验量表(MHT)中的"学习焦虑"分量表、症状自评量表(SCL-90)中的"人际关系敏感"因子以及中学生心理健康量表(MMHI)中的"适应不良"分量表对重庆市某高中492名高一新生进行调查。结果显示:(1)约84.8%的高一新生存在中等程度以上的学习焦虑,约40.9%的高一新生存在不同程度的人际关系敏感,约52.4%的高一新生存在不同程度的适应不良,且男女生在这三方面不存在显著差异;(2)人际关系敏感在高一新生学习焦虑与其适应不良之间的中介效应显著,人际关系敏感起到了完全中介作用。

大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养

目的体外分离、培养并鉴定大鼠股动脉血管原代内皮细胞,为相对较小血管来源的原代内皮细胞功能研究提供细胞模型。方法无菌取大鼠股动脉血管,胶原酶消化大鼠股动脉血管内皮细胞使其分离,流式细胞术检测内皮细胞纯度;流式分选出CD31阳性细胞,并用激光共聚焦鉴定内皮细胞;以CCK-8法、高内涵细胞成像法检测内皮细胞增殖能力,以Transwell法、Matrigel胶法检测其迁移和成管功能。结果胶原酶消化分离所得股动脉血管原代内皮细胞在14~16 d细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上,细胞呈现典型铺路石状。流式检测其纯度为38.34%,分选后利用CD31进行荧光染色鉴定,细胞均为CD31阳性;PGE2可显著上调CD31阳性内皮细胞增殖、迁移、成管功能。结论该研究采用简便的方法成功分离得到股动脉血管原代内皮细胞,为研究相对较小血管来源的原代内皮细胞功能提供体外细胞模型。

性别对咪喹莫特诱导小鼠银屑病模型建立的影响

建立咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠银屑病模型,对模型进行评价并探究性别对IMQ诱导小鼠银屑病模型建立的影响。BALB/c小鼠,雌雄各半,随机分为正常对照组、模型组1(雄性)、模型组2(雌性),将IMQ涂抹于小鼠背部皮肤建立小鼠银屑病模型。每天对小鼠皮肤进行银屑病皮损面积和严重程度(PASI)评分,HE染色观察皮肤组织病理学改变,计算脾脏指数、胸腺指数,免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达和免疫荧光法检测内披蛋白的表达情况。与对照组小鼠相比,IMQ诱导的雄性和雌性小鼠皮肤均表现出鳞屑、红斑和增厚现象并持续加重,PASI评分也呈相同的结果。HE染色发现与对照组小鼠相比,IMQ诱导的雄性和雌性小鼠表皮均增厚(P<0.001),表皮浅层可见毛细血管扩张、炎症细胞浸润、角质层可见角化不全、颗粒层变薄甚至消失、棘层肥厚、并有表皮突下延。IMQ诱导的小鼠脾脏指数增大(P<0.001),雌雄小鼠脾脏指数变化差异无统计学意义。IMQ诱导的雄性和雌性小鼠角质形成细胞表达数量增多(P<0.05),且存在异常分化现象,雌雄小鼠PCNA和内披蛋白的表达差异无统计学意义。IMQ诱导的小鼠银屑病模型与人类银屑病具有许多相似性,且性别对IMQ诱导小鼠银屑病模型的建立几乎没有影响。

IGFBP2增强IGF-1诱导的HepG2细胞增殖、迁移和侵袭

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)对胰岛素样生长因子-1(IGF-1)诱导人源肝癌(HCC)细胞株HepG2细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其机制。方法选用15.6、31.2、62.5、125、250 ng/ml的IGFBP2与50 ng/ml的IGF-1联合刺激HepG2细胞。用CCK-8法检测细胞增殖,transwell法检测细胞迁移和侵袭;Western blot检测细胞内信号通路相关蛋白的活化和表达。结果与IGF-1单独刺激相比,IGFBP2与IGF-1联合作用可增强HepG2细胞增殖、迁移和侵袭能力;IGFBP2与IGF-1联合刺激增加HepG2细胞株中IGF1R、Akt和ERK磷酸化水平,而对总表达无明显改变,同时上调早期生长反应蛋白1(EGR1)的表达。结论IGFBP2通过活化Akt及ERK信号通路增强IGF-1诱导HepG2细胞增殖、迁移和侵袭的能力。

佐剂性关节炎大鼠脾脏组织GRK2免疫荧光法建立

建立了适合佐剂性关节炎大鼠脾脏组织G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)免疫荧光测定法。考察了免疫荧光测定的4个关键条件:(1)渗透剂Triton X-100的影响;(2)不同抗原修复液:柠檬酸缓冲液和p H 9.0乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液的影响;(3)5%胎牛血清封闭不同时间(20、30、40、50min)的影响;(4)不同一抗浓度(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶500)的影响。实验结果显示,Triton X-100通透增强了抗原的表达;1∶100的一抗浓度对荧光信号强度最合适;封闭50 min能显著去除背景非特异性染色;柠檬酸缓冲液优于p H 9.0 EDTA缓冲液,提高了抗原表达。

父母教养方式对大学生亲社会行为的影响:攻击性的中介作用

本文探讨父母教养方式对大学生亲社会行为的影响以及攻击性的中介效应。采用简式父母教养方式问卷(s-EMBU)、亲社会倾向量表(PTM)和攻击性问卷(AQ)对重庆市八所高校的1098名大学生进行调查。结果发现:1) 大学生亲社会行为与父母拒绝呈显著负相关,与父母情感温暖呈显著正相关,与父母过度保护相关不显著;2) 攻击性在父母拒绝、情感温暖与大学生亲社会行为之间起部分中介作用,在父母过度保护与大学生亲社会行为之间无中介效应。