目的:鉴定RA相关自身抗原COMP的一株特异性单克隆抗体15A11的表位特征。方法:选用随机十二肽噬菌体库对m Ab 15A11进行三轮筛选,随机挑取40个单噬菌斑,提取DNA,测序;ELISA检测每个噬菌体克隆与m Ab 15A11结合的特异性;通过Clustal W2对...目的:鉴定RA相关自身抗原COMP的一株特异性单克隆抗体15A11的表位特征。方法:选用随机十二肽噬菌体库对m Ab 15A11进行三轮筛选,随机挑取40个单噬菌斑,提取DNA,测序;ELISA检测每个噬菌体克隆与m Ab 15A11结合的特异性;通过Clustal W2对特异性结合的噬菌体展示的十二肽和COMP进行氨基酸序列比对,Py MOL分析一致氨基酸所在肽链的二级结构及表位氨基酸之间的距离,初步确定m Ab 15A11的表位;变性和非变性Western blot、EDTA螯合Ca2+后ELISA分析以及合成多肽的ELISA实验进一步确定表位序列。结果:得到的40个测序噬菌体中,共有5个噬菌体克隆,ELISA确定克隆1和克隆2与m Ab 15A11特异性结合,其他克隆均为非特异性结合的噬菌体;氨基酸序列比对,在COMP上未发现与克隆1和克隆2噬菌体相同的连续氨基酸序列,提示m Ab 15A11的抗原表位可能为非线性表位;Py MOL分析表位氨基酸在COMP上的定位及距离,显示构象表位的合理性;变性Western blot分析为阴性,而非变性Western blot条件下为阳性;EDTA螯合Ca2+破坏COMP的构象后不能与m Ab 15A11结合,而未经处理的与m Ab 15A11结合,均说明m Ab 15A11表位是构象表位;合成多肽与m Ab 15A11的ELISA结果进一步确定了m Ab 15A11的构象表位序列。结论:鉴定了m Ab 15A11的表位是构象表位序列,且确定了该构象表位的氨基酸组成,为研究COMP抗体与抗原反应机制具有重要理论价值,并对类风湿性关节炎的检测有重要应用意义。展开更多
文摘目的:鉴定RA相关自身抗原COMP的一株特异性单克隆抗体15A11的表位特征。方法:选用随机十二肽噬菌体库对m Ab 15A11进行三轮筛选,随机挑取40个单噬菌斑,提取DNA,测序;ELISA检测每个噬菌体克隆与m Ab 15A11结合的特异性;通过Clustal W2对特异性结合的噬菌体展示的十二肽和COMP进行氨基酸序列比对,Py MOL分析一致氨基酸所在肽链的二级结构及表位氨基酸之间的距离,初步确定m Ab 15A11的表位;变性和非变性Western blot、EDTA螯合Ca2+后ELISA分析以及合成多肽的ELISA实验进一步确定表位序列。结果:得到的40个测序噬菌体中,共有5个噬菌体克隆,ELISA确定克隆1和克隆2与m Ab 15A11特异性结合,其他克隆均为非特异性结合的噬菌体;氨基酸序列比对,在COMP上未发现与克隆1和克隆2噬菌体相同的连续氨基酸序列,提示m Ab 15A11的抗原表位可能为非线性表位;Py MOL分析表位氨基酸在COMP上的定位及距离,显示构象表位的合理性;变性Western blot分析为阴性,而非变性Western blot条件下为阳性;EDTA螯合Ca2+破坏COMP的构象后不能与m Ab 15A11结合,而未经处理的与m Ab 15A11结合,均说明m Ab 15A11表位是构象表位;合成多肽与m Ab 15A11的ELISA结果进一步确定了m Ab 15A11的构象表位序列。结论:鉴定了m Ab 15A11的表位是构象表位序列,且确定了该构象表位的氨基酸组成,为研究COMP抗体与抗原反应机制具有重要理论价值,并对类风湿性关节炎的检测有重要应用意义。
