吉富罗非鱼IRF9基因克隆及表达特征分析

【目的】明确吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)干扰素调节因子9基因(OnIRF9)的结构特征和组织表达模式,以及无乳链球菌感染和Poly(I:C)刺激后的免疫应答情况,为揭示IRF9在罗非鱼免疫应答中的作用机制提供理论依据,进而丰富鱼类的IRF免疫学知识。【方法】通过RACE扩增OnIRF9基因cDNA序列,通过ExPASy、SMART、SignalP-5.0、TMHMM-2.0和Euk-mPLoc 2.0等在线软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR检测OnIRF9基因在健康吉富罗非鱼组织中的表达特征及无乳链球菌感染和Poly(I:C)刺激后的表达变化。【结果】OnIRF9基因cDNA序列全长1828 bp,包含50 bp的5'端非编码区(5'-UTR)、485 bp的3'端非编码区(3'-UTR)和1293 bp的开放阅读框(ORF),共编码430个氨基酸残基。OnIRF9蛋白分子量为48.42 kD,理论等电点(pI)为6.23,含有IRF典型的DBD结构域和IAD结构域,不含信号肽和跨膜结构域。OnIRF9氨基酸序列与其他硬骨鱼类IRF9氨基酸序列的相似性为56.2%~95.7%,其中与美妊丽鱼IRF9氨基酸序列的相似性最高(95.7%);基于IRF9氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示,吉富罗非鱼与其他参考鱼类聚为一簇,尤其与美妊丽鱼的亲缘关系最近。OnIRF9基因在健康吉富罗非鱼脑、血液、肌肉、肝脏、皮肤、心脏、脾脏、头肾、肠道和鳃组织中均有表达,以脑组织中的相对表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),而鳃组织中的相对表达量最低。经无乳链球菌感染和Poly(I:C)刺激后,OnIRF9基因在吉富罗非脾脏、头肾和脑组织中的相对表达量在6 h内均极显著上升(P<0.01),但其相对表达量达到峰值的时间并不一致,提示OnIRF9基因在各组织中响应免疫应答时可能具有互补协调性。【结论】OnIRF9具有IRF典型的结构域(DBD和IAD),尤其是DBD结构域的功能在脊椎动物中较保守;OnIRF9基因在中枢神经系统中发挥重要作用,且参与吉富罗非鱼抵御病原体入侵的免疫应答反应。

黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白A的原核表达与纯化

【目的】克隆黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白A(KpOmpA)基因,构建重组质粒并诱导其表达,纯化获取重组蛋白KpOmpA,为黄喉拟水龟抗肺炎克雷伯菌的相关疫苗研究奠定基础。【方法】以黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌DNA为模板,克隆获得KpOmpA基因后与pET-32a表达载体连接;将构建的重组质粒pET-32aKpOmpA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,通过SDSPAGE电泳检测KpOmpA重组蛋白的表达情况,并对重组蛋白进行可溶性分析;经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化KpOmpA重组蛋白,应用Western blot方法鉴定纯化蛋白。【结果】KpOmpA基因CDS序列全长为1071 bp,推定编码356个氨基酸,与其他肺炎克雷伯菌的OmpA氨基酸序列同源性超过99%,高度保守。重组质粒pET-32a-KpOmpA经双酶切、测序确认基因序列无移码或突变,表明重组质粒成功构建。转化后的BL21感受态细胞经终浓度为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明,KpOmpA重组蛋白大量表达,以包涵体形式存在,分子量约为57 kD。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化,获得较高纯度的重组蛋白。Western blot检测结果显示有57 kD的条带,表明KpOmpA重组蛋白能被小鼠抗His-tag单克隆抗体识别。【结论】成功构建了重组质粒pET-32a-KpOmpA,在大肠杆菌表达系统中诱导其表达,并纯化得到较高纯度的KpOmpA重组蛋白,为制备预防肺炎克雷伯菌感染的疫苗奠定基础。