脂蛋白脂酶基因HindⅢ多态性与冠心病及血脂的关系

目的 研究上海地区脂蛋白脂酶 (LPL)基因HindⅢ多态性与冠心病及血脂的关联。方法 采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)检测了 10 3例冠心病人和 12 8例正常对照者的HindⅢ多态性 ,并测定了血脂水平。结果 在正常对照组中 ,H 等位基因频率为 0 188,在冠心病组中 ,H 等位基因频率为 0 15 5 ,冠心病组H 等位基因频率略低于对照组 ,但无显著差异。在冠心病组女性中 ,H 等位基因频率低于对照组 ,差异接近显著 (P =0 .0 5 8)。在总研究组中 ,H 等位基因携带者的Trig、HDL、TC、LDL、LP(a)浓度与非携带者相比无显著差异。但在女性中 ,H 等位基因携带者的Trig显著低于非携带者 (P <0 .0 5 )。结论 LPL的HindⅢ基因多态性可能在特定性别中显示与冠心病或脂质水平的关联 ,在整个人群的水平 。

小鼠Nucleophosmin基因的克隆及基因组结构分析

Nucleophosmin(NPM)是主要的核仁磷酸化蛋白,在一些退行性大细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓性白血病等病人中可见累及NPM基因的染色体易位。建立NPM基因剔除的小鼠模型对于研究NPM基因的生物学功能及其在淋巴瘤及白血病发病中的确切作用有非常重要的意义。为获得包含NPM基因组全长序列的噬菌体克隆,以小鼠NPMcDNA为探针对129S1系小鼠λ噬菌体基因组文库进行筛选,经3轮筛选鉴定出一个包含小鼠NPM基因组全序列的噬菌体克隆。用鸟枪法对这个λ噬菌体克隆全长15.3kb进行了测序,序列经BLAST分析显示,该克隆所包含的129S1系小鼠NPM基因组序列与GenBank中C57BL/6系小鼠序列约99.8%相同。根据测序获得的基因组序列,应用生物信息学方法对小鼠NPM的基因组结构及NPM基因5′启动子区可能的转录因子结合位点等进行了分析。

BPOZ基因剔除小鼠模型的建立

BPOZ是在卵巢癌等肿瘤组织中表达下调的细胞生长抑制基因 ,建立BPOZ基因剔除小鼠模型 ,可以为在体研究BPOZ基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件 .运用生物信息学手段确定小鼠BPOZ基因组序列 ,设计基因剔除策略 ,构建完成了基因剔除载体XpPNT BPOZ .以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞 ,用G4 18和Ganciclovoir进行正负筛选 ,获得抵抗克隆 ,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆 .将同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚 ,获得嵌合体小鼠 .嵌合体小鼠与C5 7BL/ 6J小鼠交配后获得Aguoti毛色的小鼠30只 ,其中 15只为BPOZ基因剔除杂合子小鼠 ,阳性率为 5 0 % .在雌雄杂合子交配的后代中获得纯合子小鼠 .初步的表型观察发现BPOZ基因剔除小鼠发育正常 ,有繁殖能力 ,进一步的表型分析工作正在进行之中 .

BPOZ基因纯合缺失ES细胞系的建立及其生长和分化研究

研究BPOZ基因缺失对细胞生长和分化的影响.以高浓度的G418筛选BPOZ基因杂合缺失型ES细胞,PCR鉴定抗高浓度G418细胞克隆基因型;半定量RTPCR分析3种基因型ES细胞BPOZ基因的表达情况,分析3种基因型ES细胞Oct34基因的表达以明确ES细胞分化状态.利用3种基因型ES细胞进行细胞生长曲线和3H胸嘧啶核苷参入实验比较其生长速度和增殖能力.以裸鼠荷瘤实验和类胚体形成实验比较BPOZ基因纯合缺失型ES细胞与野生型ES细胞生长分化能力.结果表明,筛选获得两个BPOZ基因剔除的纯合ES细胞克隆;筛选得到的纯合ES细胞中BPOZ基因表达完全缺失,细胞处未分化状态.与野生型ES细胞相比,BPOZ基因纯合缺失型ES细胞生长受抑,增殖能力减弱.BPOZ基因纯合缺失型ES细胞可分化形成类胚体和具备来自3个不同胚层的细胞和组织的畸胎瘤.BPOZ基因剔除使ES细胞生长受抑,对ES细胞分化发育没有明显影响.

脂蛋白脂酶与冠心病

血脂代谢异常和冠心病的关系非常密切 ,脂蛋白脂酶是脂质代谢中的关键酶 ,脂蛋白脂酶基因变异和血脂代谢异常以及冠心病有密切关联。本文就脂蛋白脂酶的性质、结构、基因变异与冠心病的关系作一综述。

hOPG基因启动子驱动报告基因LacZ的转基因小鼠模型的建立

目的:建立带有人类骨保护素OPG基因启动子驱动报告基因LacZ的转基因小鼠模型,为OPG体内转录水平的表达调控研究和药物筛选创造条件。方法:将克隆到的人类OPG基因5′端上游6.0kb非翻译序列作为启动子,大肠杆菌编码β半乳糖苷酶的LacZ基因作为报告基因,构建表达载体pCINeoOPGLacZ。经显微操作注射到受精卵原核中,经PCR以及Southern印迹杂交鉴定转基因阳性小鼠;用RTPCR分析LacZ在组织中的表达;利用邻硝基苯βD半乳吡喃糖苷(ONPG)作为底物反应后比色分析组织中的β半乳糖苷酶活性。结果:构建完成的表达载体pCINeoOPGLacZ质粒经酶切和测序鉴定序列正确,线性化后显微注射。PCR以及Southern印迹杂交鉴定获得了10只转基因小鼠(Founders),经交配繁育,建立了5个转基因小鼠系,RTPCR分析表明其中一个系小鼠组织中表达LacZ基因,与内源OPG表达模式一致,组织中可以广泛检测到相应的β半乳糖苷酶活性。结论:成功建立了人类OPG基因启动子驱动报告基因LacZ的转基因小鼠,为体内研究OPG转录水平的表达及药物筛选提供了理想的动物模型。

单链构象多态性分析检测脂蛋白脂酶基因变异

目的:建立聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测脂蛋白脂酶（LPL）基因Hind Ⅲ多态性、Ser447Ter多态性及-93T/G基因突变的方法。方法:5μl Hind Ⅲ多态性或-93T/G基因突变的PCR产物和5μl甲酰胺变性液混匀变性,室温下用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染。5μl Ser447Ter多态性的PCR产物和2μl甲酰胺变性液混匀变性,25℃左右用8％的聚丙烯酷胺凝胶电泳后银染。结果:PCR-SSCP成功检出LPL的Hind Ⅲ多态性、Ser447Ter多态性及-93T/G基因突变,并检出第9内含子50位一个G碱基缺失和启动子区域-85位一个C-T碱基置换即-85C/T。同时PCR-RFLP验证了200例标本的PCR-SSCP检测结果,两种方法检测已知基因变异时的结果完全一致。结论:PCR-SSCP法既能检测已知的LPL基因变异,也可检出未知的LPL基因变异,是临床实验室开展基因诊断的一种简便、有效的方法。