《已上市生物制品药学变更研究技术指导原则(试行)》解读

为了给药品上市后监管提供技术支撑,按照国家药监局统一部署,国家药监局药品审评中心制定了《已上市生物制品药学变更研究技术指导原则(试行)》,并于2021年6月发布,受到了广泛关注。本文详细论述了在基于风险进行分类管理的上市后监管制度下,药品质量体系在变更中的重要作用,明确了基于变更进行分类管理及开展相关研究的基本原则,并对几个具有代表性的变更事项的分级及需要开展的技术研究进行了说明,以期加强指导原则的指导作用。

HCV核心蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性的初步评价

通过逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从丙肝患者的血清中分离出编码完整ＨＣＶ核心蛋白（Ｃ区）的ｃＤＮＡ片段，并将其克隆到杆状病毒转移质粒中。重组转移质粒ＤＮＡ与线性的杆状病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞，经蚀斑筛选获得了带编码全部核心蛋白基因的重组杆状病毒。重组病毒感染细胞后表达ＨＣＶ核心蛋白，其分子量的为２０ｋＤ。免疫印染和酶联免疫实验表明，此重组蛋白能被人ＨＣＶ阳性血清所识别。动物实验表明此重组蛋白能诱导小鼠产生特异性抗体。

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白基因在昆虫细胞中的表达及其初步鉴定

从乙肝阳性人血清中克隆HBV含前s区表面抗原基因（PreSZ＋S），将其插入到杆状病毒转移质粒PVL1393中，并与昆虫病毒ACNPVDNA共转染Sf9昆虫细胞，筛选出重组病毒。用乙肝放免（RIA）试剂盒及EIAPreS2－Ag检测试剂盒检测重组病毒感染的Sf9细胞，表明细胞中有HBsAg及PreS2－Ag存在。将重组病毒感染的细胞免疫小鼠，在小鼠血清中能检测到anti-HBsAg及anti-PreS2抗体。

呼吸道合胞病毒融合蛋白第168～289氨基酸片段的表达与纯化

目的：利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达RSV融合蛋白中主要抗原性区域的片段（第168～289氨基酸）并纯化重组蛋白。方法：在人胚肺二倍体细胞2BS株上培养RSV Long株,从培养物中提取病毒总核酸。采用RT-PCR法从RSV基因组RNA中扩增出F基因546-881 bp片段（F′）,F′插入到转移载体质粒pBacPAK9中再与线性杆状病毒BacPAK6 DNA（Bsu36I digested）共转染Sf9昆虫细胞。重组蛋白经镍离子柱螯合亲和层析纯化。经SDS-PAGE和West-ern-Blot鉴定重组蛋白。结果：外源基因在昆虫细胞中获得了表达,并通过其所带的信号肽分泌到了无血清培养基中。表达产物的分子量约为15×10^3,与理论值相符。结论：成功地用昆虫细胞表达系统表达了能分泌到培养基中的呼吸道合胞病毒F基因546-881 bp片段编码的融合蛋白第168～289氨基酸片段。

关于生物类似药研发与评价的思考

目的探讨生物类似药研发评价的相关问题。方法结合《生物类似药研发与评价技术指导原则》(试行)(以下简称《指导原则》)的起草工作,从生物类似药的起源、现行法规中相关内容、对于生物类似药的理解、生物类似药的研发评价思路、研发与评价的问题与难点等方面探讨交流生物类似药及候选药的内在特性与研发风险。结果与结论建议参照国内颁布的《指导原则》设计适宜的比对性研究,选择适宜的研发路径,评估论证研发工艺、生产规模、研究批次的代表性及合理性,清醒认识比对研究中的技术要求、相似性评判的难度和复杂性,慎重选择和开发生物类似药。

重组单克隆抗体相关物质和相关杂质的研究与评价

重组生物技术制备的单克隆抗体(以下简称重组单抗)是生物制品中一类重要的药物类别。近年来,由于其精确的靶向杀伤和中和等生物学效应,重组单抗在肿瘤、自身免疫性疾病等方面受到了广泛的研究和应用,并且在神经学、眼科学等其他疾病领域的研究也开始逐步发展起来。目前,国内生产的重组单抗主要采用真核细胞培养表达的方法,在工艺研发和质量研究方面,药品企业对主要有效成分的结构研究和质量控制关注较多;但是对产品组成中的杂质和相关物质研究较少或关注度不够。考虑到这些杂质或相关物质是重组单抗产品中的重要组成部分,将会影响到产品的质量、临床应用的安全性和有效性,应在研究中予以重视。本文对重组单克隆抗体产品中相关杂质和相关物质的研究和评价进行了探讨。

真核细胞表达重组蛋白糖基化研究与评价

糖基化是真核细胞表达重组蛋白常见的修饰形式,这种修饰形式影响到蛋白质的空间结构、生物活性、稳定性、溶解性、免疫原性等,进而影响到重组蛋白质在体内的动力学、代谢和组织分布。因而,真核细胞表达的生物制品药物的糖基化研究是产品结构研究和质量控制的重点关注课题。本文围绕真核细胞表达重组蛋白糖基化的影响因素、分析方法、质量控制与评价几个方面进行探讨。

百日咳毒素亚基基因的克隆与表达及其重组亚基的免疫学特性

目的从百日咳包特杆菌ＣＳ株中克隆百日咳毒素（ＰＴ）及其各亚基的基因，并探讨在昆虫细胞中表达百日咳毒素亚基基因片段的可能性及表达产物的生物学特性。方法采用ＰＣＲ技术进行克隆，并通过限制性内切酶和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ进行分析鉴定。利用重组杆状病毒技术，在昆虫细胞Ｓｆ９中表达各亚基基因，并通过免疫荧光实验进行分析鉴定，通过ＥＬＩＳＡ实验进行重组蛋白的免疫学特性评价。结果获得百日咳毒素及其各亚基的基因，并在昆虫细胞中表达了重组亚基。经体外聚合后的各重组亚基混合物与抗天然完整ＰＴ免疫血清的反应性和诱生特异性抗ＰＴ抗体的能力都明显高于各重组亚基单体混合物，含有Ｓ１重组亚基混合物诱生特异性抗ＰＴ抗体水平又明显高于不含Ｓ１重组亚基混合物的水平。说明百日咳毒素亚基单体仅具有很弱的诱生特异性抗ＰＴ抗体的能力，且抗完整ＰＴ的抗血清对百日咳毒素亚基单体也缺乏很好的识别作用。结论百日咳毒素诱导产生特异性抗体的能力依赖于聚合体的空间构型，而且其主要抗原决定簇位于聚合体的Ｓ１亚基上。

基于疫苗管理及技术特点浅析疫苗上市后变更注册的几点特殊考虑

上市后变更作为生物制品全生命周期管理的重要环节之一,可能给生物制品质量带来潜在影响。预防用疫苗在法规要求、产品特点、生产质控等方面与其他生物制品有所不同,因此在开展上市后变更研究和注册时存在特殊考虑。本文就疫苗产品与其他生物制品开展上市后变更进行了技术要求对比分析,提炼了疫苗上市后变更研究的若干特别考虑因素,以期对疫苗持有人做好上市后变更研究有所助益。

HIV 外膜糖蛋白 gp120 和 gp41 在昆虫细胞中表达及其免疫学特性的评价

将编码完整ｇｐ１２０和完整ｇｐ４１的基因分别克隆到杆状病毒转移质粒中。使用重组转移质粒与野生杆状病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞，经挑选获得分别带有编码ｇｐ１２０和ｇｐ４１基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Ｓｆ９细胞后在细胞中分别表达了ＨＩＶ外膜糖蛋白ｇｐ１２０和ｇｐ４１。其重组蛋白的分子量分别为１２０×１０３和４１×１０３。此重组糖蛋白在免疫荧光、免疫印染和酶联免疫实验中都能被ＨＩＶ阳性血清所识别。动物免疫实验表明此重组糖蛋白能诱导很强的特异性抗体产生。

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白I基因在昆虫细胞中的表达及纯化

目的 将北京水痘 带状疱疹病毒 (VZV) 84 7株克隆糖蛋白I(gpI)基因在杆状病毒 昆虫细胞表达系统中表达 ,并对其表达产物进行纯化。方法 采用PCR方法从VZVDNA中扩增gpI全基因序列 ,并将其插入杆状病毒转移质粒 pBacPAK9中 ,获得重组转移质粒pBacVZVgpI ,对pBacVZVgpI中的插入基因进行测序。重组转移质粒与线性杆状病毒BacPAK6DNA (Bsu36Idigested)共转染Sf9昆虫细胞 ,获得重组病毒BacPAK gpI。通过亲和层析纯化重组蛋白 ,并检测其抗原性。结果 PCR扩增得到 gpI基因 ,测序结果表明克隆的外源基因正确。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)、免疫印迹 (western blot)方法证明gpI基因在昆虫细胞中获得表达 ,表达产物在培养 72h达到高峰 ,重组蛋白的相对分子质量约为 5 80 0 0和 70 0 0 0 ,与理论值相符 ,蛋白质加工与天然蛋白类似。动物实验结果表明 ,重组蛋白具有较好的免疫原性 ,可刺激小鼠产生中和抗体。SDS PAGE检测纯化的重组蛋白 ,纯度达 80 %。纯化蛋白经western blot和ELISA检测后显示 ,具有特异的抗体结合活性。结论 应用昆虫细胞表达水痘 带状疱疹病毒 gpI基因 ,可为水痘 带状疱疹病毒抗原定量分析、糖蛋白ELISA的研制和制备亚单位疫苗提供基础。

呼吸道合胞病毒F蛋白第168～289氨基酸片段的昆虫细胞表达及其抗原性分析

目的研究人呼吸道合胞病毒（RSV）F基因第546～881碱基编码的融合蛋白（即F蛋白）主要抗原性区域第168～289氨基酸片段的抗原性初步探讨其作为诊断抗原的应用价值。方法用逆转录（RT）-PCR的方法扩增出RSVLong株F基因546～881bp片段（F’），将其插入到转移载体质粒pBacPAK9中，获得相应的重组质粒pBacRSVF’，与线性杆状病毒BacPAK6DNA（Bsu36I酶切）共转染Si9昆虫细胞获得重组病毒BacPAKF’，并在昆虫细胞中表达。重组蛋白用Ni2＋螯合柱亲和层析纯化，用免疫印迹（Westernblot，WB）法检测重组蛋白的抗原活性。并用该方法检测33例急性下呼吸道感染患儿血清特异性抗体，同时用间接免疫荧光法检测患儿的鼻咽分泌物中RSV抗原。对两种方法检测标本的阴性率进行比较。结果重组病毒BacPAKF’在昆虫细胞中表达相对分子质量约13000的重组蛋白。纯化后的重组蛋白能与特异性抗RSV抗体结合。WB检测33例急性下呼吸道患儿血清特异性抗体，结果显示阳性11例，阳性率为33．3％，免疫荧光法检测结果阳性9例，阳性率为27．3％，2种检测方法阳性率差异无统计学意义（X2=0．29，P〉0．05）。结论纯化后的在昆虫细胞中表达的RSVF基因546-881bp片段编码的融合蛋白片段具有较强的抗原活性，对RSV感染的快速诊断具有一定的临床应用价值。

关于预防性疫苗异常毒性检测的几点思考

通常含预防性疫苗在内的所有人用生物制品在灌装后的终产品阶段均需通过一项毒性或安全性检测[1],即异常毒性检测。这项检测最早在20世纪初(1900s)开始发展作为确保血液制品生产安全性及一致性的手段,之后拓展为用于所有生物制品检测外源污染物的一般化安全性检测。异常毒性检测曾一度为世界卫生组织技术指南(WHO Recommendations and Guidelines)及各国国家药典(National Pharmacopoeias)所推行[2]。但近年来随着疫苗研发、生产及质控等水平提高和产业升级,人们对异常毒性检测的意义、要求、方式、操作等各方面提出了疑问。