猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株细菌人工染色体的构建与鉴定

为构建猪源伪狂犬病病毒(PRV)变异株AH02LA的细菌人工染色体(BAC),本研究将转移载体pHA2-pUC19-H1-H2的DNA与PRV AH02LA株基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,利用转移载体中的GFP为筛选标记,获得携带GFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV-AH02LA(gE-/gI-)-pHA2。提取纯化的该重组病毒DNA转化E.coli DH10B,对获得的阳性克隆命名为BAC^(PRV-G)。提取BAC^(PRV-G)的DNA,将含gE、gI和其上下游同源片段的DNA与BAC^(PRV-G)的DNA共转染CEF,获得gE、gZ基因恢复的病毒命名为PRVAH02LA^(Rec)。比较亲本株PRV AH02LA、基因缺失株和恢复株的生长动力学,结果表明,恢复株的生长特性与亲本株无显著差异。本研究成功构建了PRV变异株AH02LA的BAC,并证实其为全基因组的感染性克隆,为PRV变异株的致病机理研究和新型疫苗研制提供了重要的平台。

表达禽流感病毒H5亚型基因重组鸭瘟病毒的构建

为了应用和发展鸭肠炎病毒(DEV)载体疫苗,基于细菌人工染色体(BAC)人工合成带有p MCMV IE启动子和HA基因序列的表达盒,将其插入到UL55和LORF11之间的非编码区,从而构建出DEV载体疫苗。RFLP分析结果显示DEV BAC及其突变体条带与预期结果存在轻微的差异,将BAC及其突变体拯救后发现其生长性能与亲本病毒没有显著差异。间接免疫荧光和Western blot结果显示,载体疫苗在感染鸡胚成纤维细胞(CEF)后大量表达了HA蛋白质。表明成功构建了能稳定表达禽流感病毒H5亚型基因重组鸭瘟病毒。

猪伪狂犬病病毒AH02LA株的分离鉴定及其对仔猪致病性研究

从安徽六安某爆发伪狂犬病猪场送检的流产仔猪脑组织样品中分离获得1株病毒,经鉴定为伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）,命名为PRV AH02LA株。PRV AH02LA株的糖蛋白g D和g I基因序列与2011年以来我国分离的变异株同源性最高（99.5%~100%）,而与其他毒株同源性低。该分离株在BHK21细胞上增殖能力强,最高滴度达到109.0TCID50/m L。该分离株对4~5周龄和9~10周龄的PRV阴性猪能引起100%发病和死亡。临床上4~5周龄猪有严重的神经症状,也有明显的呼吸道症状;而9~10周龄猪主要表现呼吸道症状。说明本研究分离获得的PRV AH02LA是一株伪狂犬病毒变异株,其对仔猪的致病力较强。

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)对变异株的保护效力

本研究旨在检测仔猪免疫猪伪狂犬病活疫苗（Bartha K61株）后,抵抗伪狂犬病病毒（PRV）变异株攻击的保护效果。取4～6周龄PRV抗体阴性仔猪,接种猪伪狂犬病活疫苗,1周后用PRV变异株（AH02LA株）攻毒,检测攻毒后临床症状、直肠温度、鼻腔排毒和肺部病变。疫苗免疫组在免疫后7 d均可以检测到gB抗体。攻毒对照组攻毒后出现典型伪狂犬症状,发病率为100%,死亡率为60%,所有猪只鼻拭子均检出排毒,所有猪只肺部均有出血、淤血等病变。免疫组的猪只攻毒后,所有猪只均未出现明显临床症状,部分猪只鼻拭子检出排毒,排毒持续时间缩短,排毒量显著减少,所有免疫猪只肺部未见明显病变。结果表明：伪狂犬病活疫苗免疫猪后对PRV变异株的攻击具有良好的保护效果。